常規(guī)體外受精與卵泡漿內(nèi)單精子注射中異常受精胚胎形成的影響因素分析

王金鸞 張寧 李婷婷

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

在常規(guī)體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)過程中，正常胚胎的形成受到精卵質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)環(huán)境等多種因素影響，胚胎形成過程中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)錯(cuò)誤都可能會造成異常受精胚胎的出現(xiàn)。異常受精是指受精過程中未觀察到雌雄兩個(gè)原核(2PN)，受精卵出現(xiàn)原核數(shù)目的異常，包括未見原核(0PN)、單原核(1PN)、多原核(≥3PN)[1]。在實(shí)驗(yàn)室胚胎觀察過程中，精卵結(jié)合后出現(xiàn)異常受精的胚胎通常不作為移植的首選胚胎，甚則直接遺棄此類胚胎，不僅造成胚胎的浪費(fèi)，同時(shí)高異常受精率給高齡、卵巢功能減退等患者也帶來巨大的經(jīng)濟(jì)、生理以及心理負(fù)擔(dān)[2]。本研究通過Logistic回歸分析分析常規(guī)IVF/ICSI中可能導(dǎo)致異常受精胚胎形成的影響因素，以期提高臨床上卵母細(xì)胞的利用率，減少胚胎浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

回顧性分析2019年1月—2020年5月就診于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心的IVF/ICSI助孕的1 018個(gè)周期患者的臨床資料。按照是否有異常受精將患者分為異常受精組(n=871)和對照組(n=147)，其中異常受精組至少出現(xiàn)1個(gè)非雙原核(2PN)的受精卵。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡≥20歲；夫婦染色體正常；女方免疫學(xué)檢查正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：短時(shí)受精的患者；嚴(yán)重遺傳性疾病患者；供精、供卵患者；獲卵數(shù)為0的患者。

1.2 控制性超促排卵(COH)方案

根據(jù)患者的具體情況選擇常規(guī)的黃體期長方案或者拮抗劑方案。黃體期長方案：在前次月經(jīng)的黃體中期注射半支長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α，達(dá)菲林，規(guī)格3.75 mg/支，法國博福-益普生制藥有限公司)降調(diào)節(jié)，垂體達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)[雌二醇(E2)的水平<50 ng/L，黃體生成激素(LH)的水平<5 U/L，子宮內(nèi)膜厚度<4～5 mm，無功能性囊腫]后使用促性腺激素(Gn)，注射重組卵泡刺激素(FSH，果納芬，規(guī)格450 U，瑞士默克雪蘭諾有限公司；或普麗康，規(guī)格600 U，美國默沙東公司)或人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，規(guī)格75 U，珠海麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)促排卵，根據(jù)陰道超聲下卵泡數(shù)目、大小和血清性激素水平確定Gn的起使劑量。當(dāng)患者2～3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18～20 mm時(shí)，肌內(nèi)注射10 000 U人絨毛膜促性腺激素(hCG，珠海麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)進(jìn)行扳機(jī)，36 h左右行陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。拮抗劑方案：月經(jīng)第2～3天根據(jù)患者情況使用Gn 75～300 U啟動，陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，從主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)12～14 mm時(shí)開始每天加用GnRH拮抗劑0.25 mg(思則凱，規(guī)格0.25 mg/支，瑞士默克雪蘭諾有限公司)直至hCG日，扳機(jī)后取卵。

1.3 授精及胚胎評價(jià)

實(shí)驗(yàn)室胚胎受精方式(IVF/ICSI)結(jié)合患者自身情況加以選擇。IVF適應(yīng)證：①女方因各種因素導(dǎo)致的配子運(yùn)輸障礙；②排卵障礙；③子宮內(nèi)膜異位癥；④男方少、弱精子癥；⑤不明原因不孕；⑥免疫性不孕。ICSI適應(yīng)證：①嚴(yán)重的少、弱、畸精子癥；②不可逆的梗阻性無精子癥；③生精功能障礙；④免疫性不育；⑤體外受精失??；⑥精子頂體異常。取卵當(dāng)日男方手淫法取精后，采用上游法優(yōu)化處理精子。取卵4～6 h后按照常規(guī)IVF/ICSI的操作方式進(jìn)行授精，16～18 h后觀察原核及極體的出現(xiàn)情況，依此判斷受精情況。

1.4 觀察指標(biāo)

①女方年齡：按照年齡分為20～30、31～35、≥36歲；②基礎(chǔ)FSH(bFSH)：按照bFSH的水平分為<10 U/L、≥10 U/L；③基礎(chǔ)E2(bE2)：按照bE2水平分為<25、25～45、>45 ng/L；④體質(zhì)量指數(shù)(BMI)：按照中國人BMI分級標(biāo)準(zhǔn)分為<24、≥24 kg/m2；⑤用藥治療方案：包括黃體期長方案、拮抗劑方案；⑥男方前向精子運(yùn)動率(PR)：按照男方PR分為<32%、≥32%；⑦人絨毛膜促性腺激素(hCG)日E2：按照hCG日E2的水平分為<2 000、2 000～3 000、>3 000 ng/L；⑧實(shí)驗(yàn)室受精方式：包括常規(guī)IVF、ICSI。將上述資料進(jìn)行比較分析，研究其與異常受精胚胎形成的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例(χ/%)表示，單因素分析采用χ2檢驗(yàn)，異常受精胚胎形成的影響因素采用二分類多因素Logistic回歸分析進(jìn)行分析。所有分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 異常受精胚胎形成影響因素的單因素分析

單因素分析結(jié)果表明，兩組女方年齡、bFSH、bE2、用藥方案、精液PR率、hCG日E2水平、實(shí)驗(yàn)室受精方式比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.674～74.908，P<0.05)；兩組的BMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 異常受精胚胎形成影響因素的單因素分析[例(χ/%)]

2.2 異常受精胚胎形成影響因素的多因素Logistic回歸分析

將是否存在異常受精胚胎作為因變量(無=0，有=1)，將上述單因素分析有統(tǒng)計(jì)意義的因素作為自變量，納入Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析。變量賦值如下：①女方年齡：20～30歲=0，31～35歲=1，≥36歲=2；②bFSH水平：<10 U/L=0，≥10 U/L=1；③bE2水平：<25 ng/L=0，25～45 ng/L=1，>45 ng/L=2；④用藥方案：拮抗劑方案=0，黃體期長方案=1；⑤精液PR率：<32%=0，≥32%=1；⑥hCG日E2水平：<2 000 ng/L=0，2 000～3 000 ng/L=1，>3 000 ng/L=2；⑦實(shí)驗(yàn)室受精方式：常規(guī)IVF=0，ICSI=1。結(jié)果顯示，女方年齡≥31歲、hCG日E2水平>3 000 ng/L是異常受精胚胎形成的危險(xiǎn)因素；黃體期長方案、ICSI的受精方式是異常受精胚胎形成的保護(hù)因素(P<0.05)。見表2。

表2 異常受精胚胎形成影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

隨著臨床醫(yī)療水平的提高和輔助生殖技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，IVF、ICSI的成功率逐年上升，但輔助生殖技術(shù)中胚胎的多精受精率仍達(dá)2%～10%[3-5]。在臨床實(shí)踐中，0PN、1PN、≥3PN胚胎臨床利用率低，與2PN胚胎相比，其發(fā)育異常可能性更高[6]。一部分生殖中心對于無可利用2PN胚胎的患者，會選擇0PN胚胎進(jìn)行移植。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，0PN胚胎的囊胚形成率為16.7%，其中包含44.4%的正常染色體胚胎[7]，說明0PN來源的胚胎移植理論上具有一定的可實(shí)施性。趙雙丹等[8]研究發(fā)現(xiàn)，0PN+2PN移植組的種植率與臨床妊娠率均顯著低于2PN移植組，考慮0PN來源的胚胎存在一定的遺傳缺陷，應(yīng)謹(jǐn)慎用于臨床移植。1PN胚胎的形成機(jī)制主要與孤雌激活[9]和兩個(gè)原核過早融合相關(guān)[10-11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，IVF中1PN來源胚胎的囊胚養(yǎng)成率顯著低于2PN來源胚胎(14.8%與36.4%)，ICSI則分別為6.6%和34.0%[12]?！?PN胚胎的形成與染色體異常密切相關(guān)，包括復(fù)雜嵌合體、三倍體等[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與正常受精胚胎相比，異常受精胚胎細(xì)胞碎片率高、發(fā)育速度慢、潛能差[6,13]。在臨床診療中，醫(yī)生應(yīng)首選2PN胚胎進(jìn)行移植，若無2PN來源胚胎時(shí)，0PN/1PN胚胎可作為備選胚胎，經(jīng)患者充分知情同意后選擇性進(jìn)行移植。

異常受精的發(fā)生與卵子成熟障礙、精卵結(jié)合異常等諸多因素相關(guān)。本研究單因素分析結(jié)果顯示，女方年齡、bFSH、bE2水平、用藥方案、精液PR率、hCG日E2水平、實(shí)驗(yàn)室受精方式均與異常受精胚胎的出現(xiàn)具有顯著相關(guān)性，而進(jìn)一步采用多因素Logistic回歸分析表明，女方年齡≥31歲、hCG日E2水平>3 000 ng/L是異常受精胚胎形成的危險(xiǎn)因素；黃體期長方案、ICSI的受精方式是異常受精胚胎形成的保護(hù)因素。

女性年齡對卵母細(xì)胞質(zhì)量有重要影響，年齡越大，卵巢儲備功能及卵子質(zhì)量越差，優(yōu)質(zhì)卵子率及優(yōu)質(zhì)胚胎率越低，可利用胚胎數(shù)減少，妊娠率及活產(chǎn)率均受影響[14-15]。有研究表明，高齡女性因卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，線粒體的數(shù)量減少及功能減退，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成減少，供能不足，影響細(xì)胞減數(shù)分裂，造成胚胎異常受精率升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，女性年齡≥31歲是異常受精的相關(guān)危險(xiǎn)因素，高齡造成女性卵子不可逆老化，而卵子老化對卵母細(xì)胞胚泡產(chǎn)生率及囊胚形成率均有影響，無法支持正常受精的發(fā)生[17]。

卵母細(xì)胞在受精過程中釋放的皮質(zhì)顆?？深A(yù)防多精受精的發(fā)生，不成熟的卵母細(xì)胞其皮質(zhì)顆粒功能不足，易增加多精受精的發(fā)生概率[18]。本研究結(jié)果顯示，異常受精組的hCG日E2水平明顯高于正常受精組，hCG日E2水平>3 000 ng/L是異常受精胚胎形成的危險(xiǎn)因素。hCG日E2水平升高可增加獲卵數(shù)，提高卵子成熟率。但有報(bào)道稱HCG日的高E2水平會影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，可能與補(bǔ)充外源性Gn后出現(xiàn)卵巢高反應(yīng)相關(guān)[19]。ANDERSEN等[20]研究發(fā)現(xiàn)，輔助生殖技術(shù)中外源性Gn的使用易造成卵母細(xì)胞發(fā)育代謝異常、胞核與胞質(zhì)發(fā)育不同步等問題，而卵巢高反應(yīng)在一定程度上加重了卵母細(xì)胞的異常，增加了受精異常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。SANTOS等[21]研究表明，超促排卵可增加卵母細(xì)胞的非整倍體率，影響卵母細(xì)胞質(zhì)量。而HCG日高E2水平會造成胚胎發(fā)育速度的減緩，降低優(yōu)質(zhì)胚胎率[22]。

常規(guī)IVF/ICSI受精方式的選擇具有其相對應(yīng)的適應(yīng)證，不同的受精方式對胚胎的形成發(fā)育有一定的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，ICSI的受精方式是異常受精胚胎形成的保護(hù)因素。有研究表明，與ICSI相比，IVF的多原核受精率明顯增高[23]。ICSI授精時(shí)會對卵母細(xì)胞進(jìn)行挑選，排除未成熟或過熟的卵子，而IVF為精卵自由結(jié)合，卵母細(xì)胞發(fā)育的同步性受不同促排卵方案的影響，因此精子與不成熟卵子或過熟卵子的結(jié)合概率較ICSI增加，故多原核受精率升高。張亞楠等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與IVF相比，ICSI的0PN及1PN胚胎發(fā)生率更低，體外受精方式是形成0PN及1PN胚胎的重要影響因素，與本研究結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果表明，黃體期長方案是異常受精胚胎形成的保護(hù)因素。黃體期長方案應(yīng)用GnRH激動劑抑制垂體的反應(yīng)性，使得自身分泌的FSH、LH減少，卵泡的發(fā)育主要依賴于外源性Gn，卵泡發(fā)育同步性較好，成熟度也較為一致。近年來拮抗劑方案憑借其治療時(shí)間短、費(fèi)用少的優(yōu)勢，臨床應(yīng)用較為廣泛[25]。拮抗劑方案應(yīng)用GnRH拮抗劑競爭性結(jié)合垂體的GnRH受體，對自身分泌的FSH、LH抑制較輕，卵母細(xì)胞發(fā)育受內(nèi)源性Gn與外源性Gn的共同影響，其發(fā)育的同步性明顯變差，可能影響卵母細(xì)胞的成熟度，導(dǎo)致未成熟卵子、過熟卵子與精子結(jié)合，造成異常受精胚胎的出現(xiàn)。朱潔茹等[26]研究發(fā)現(xiàn)，拮抗劑方案的獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)均顯著低于黃體期長方案。LIN等[27]根據(jù)hCG日優(yōu)勢卵泡的不同比例將患者分為高、中、低優(yōu)勢卵泡組，GnRH-α長方案中低優(yōu)勢卵泡組(優(yōu)勢卵泡比例<20%)的正常受精率最高，拮抗劑方案中低優(yōu)勢卵泡組的臨床妊娠率與高優(yōu)勢卵泡組相比明顯降低。同時(shí)大數(shù)據(jù)研究表明，卵巢低反應(yīng)人群中，拮抗劑方案的使用率為53%，而黃體期長方案的使用率僅為9%，拮抗劑方案的納入人群存在一定的偏向性，可能影響異常受精的發(fā)生[28]。

綜上所述，女方年齡、hCG日E2水平、用藥方案、實(shí)驗(yàn)室受精方式均是常規(guī)IVF/ICSI中異常受精胚胎形成的影響因素。本研究為單個(gè)生殖中心數(shù)據(jù)的回顧性分析，缺乏多地區(qū)、多中心、大樣本量的前瞻性研究數(shù)據(jù)分析，研究結(jié)果可能存在一定的偏倚。但對臨床工作的開展仍有一定的提示意義，臨床工作者應(yīng)了解形成異常受精胚胎的影響因素及其危害性，結(jié)合患者情況綜合判斷，采取相應(yīng)的預(yù)防及治療措施，提高卵母細(xì)胞利用率，為減少胚胎浪費(fèi)、降低異常受精胚胎發(fā)生率提供指導(dǎo)。