胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)特征在胚胎選擇中的應(yīng)用價(jià)值

鄭愛燕，王瑋，蒲艷，廖桂芝，孟慶霞，偶健，王馥新，李紅，丁潔

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

胚胎非整倍性是導(dǎo)致體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠失敗和早期流產(chǎn)的重要原因之一。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)的出現(xiàn)使胚胎非整倍性檢出成為可能，但該操作需對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)進(jìn)行活檢，具有創(chuàng)傷性，可能影響胚胎種植潛能[1]。另外，PGT價(jià)格昂貴，會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其能否在IVF-ET領(lǐng)域廣泛應(yīng)用仍待商榷。因此，我們希望能夠通過無創(chuàng)方法選擇更具發(fā)育潛能的胚胎。從形態(tài)學(xué)角度評(píng)判胚胎質(zhì)量是最直接也是目前最常用的方法。胚胎實(shí)時(shí)觀測(cè)技術(shù)(Time-lapse)的出現(xiàn)使人們可以進(jìn)一步觀察胚胎發(fā)育的整個(gè)過程，以及胚胎的特殊分裂行為，如直接分裂(AC)、逆分裂(RC)和亂分裂(CC)等。有研究表明形態(tài)學(xué)指標(biāo)、動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與胚胎整倍性相關(guān)[2-4]，但也有學(xué)者持反對(duì)觀點(diǎn)[5-6]。由于胚胎發(fā)育受培養(yǎng)環(huán)境等眾多因素影響[7]，所以研究數(shù)據(jù)在不同實(shí)驗(yàn)室之間的可重復(fù)性差[8]。因此，本研究從形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩個(gè)角度出發(fā)，分析本中心行PGT患者的臨床資料，以尋找指導(dǎo)胚胎選擇的形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，優(yōu)化胚胎選擇方案以改善種植結(jié)局。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016年1月至2018年12月于我院生殖與遺傳中心就診的行PGT患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：夫妻一方或雙方染色體異?；蛴羞z傳疾病，反復(fù)妊娠丟失，反復(fù)種植失敗，反復(fù)流產(chǎn)或高齡(年齡≥38歲)，且受精方式為卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：無可用囊胚的PGT周期或未放入時(shí)差培養(yǎng)箱培養(yǎng)的PGT周期。

本研究共納入193個(gè)周期。根據(jù)胚胎整倍性分為整倍體囊胚組(整倍體組，共351個(gè)囊胚)和非整倍體囊胚組(非整倍體組，共491個(gè)囊胚)；整倍體組又根據(jù)是否種植分為種植胚胎組(種植組，共110例患者)和非種植胚胎組(非種植組，共51例患者)。

二、研究方法

1.促排卵及取卵：患者進(jìn)行常規(guī)促排卵，待優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)18～20 mm時(shí)，長(zhǎng)方案患者注射6 500 U重組人絨毛膜促性腺激素(默克，德國(guó))，拮抗劑方案患者注射0.2 mg醋酸曲普瑞林(輝凌，瑞士)或2 000～40 000 U注射用人絨毛膜促性腺激素(珠海麗珠醫(yī)藥)+0.1 mg醋酸曲普瑞林，注射34～36 h后在陰道B超引導(dǎo)下取卵，將獲得的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)洗滌干凈后置于含蛋白的受精液G-IVF Plus(Vitrolife，瑞典)中備用。

2.胚胎實(shí)時(shí)觀測(cè)和胚胎培養(yǎng)：獲卵2～4 h后用透明質(zhì)酸酶(Sage，美國(guó))去除COCs周圍的顆粒細(xì)胞，置于G1 plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)1～2 h行ICSI，ICSI后將卵母細(xì)胞放回G1 plus培養(yǎng)液于常規(guī)培養(yǎng)箱過夜，培養(yǎng)箱環(huán)境為6.0%CO2、5.0%O2、37℃。受精17～19 h后觀察受精情況。將2PN合子放入培養(yǎng)皿(Embryoslide，Vitrolife，丹麥)，置于時(shí)差培養(yǎng)箱(Embryo Scope，Vitrolife，丹麥)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為6.0%CO2、5.0%O2、37℃，設(shè)置拍攝間隔為10 min，連續(xù)拍攝6 d。

3.Time-lapse系統(tǒng)和胚胎評(píng)分：運(yùn)用Viewer D圖像分析軟件收集2PN胚胎資料，記錄每個(gè)胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，包括原核消失、2細(xì)胞、3細(xì)胞、4細(xì)胞、5細(xì)胞、8細(xì)胞、桑椹胚融合、開始出現(xiàn)囊腔以及囊腔充滿整個(gè)透明帶的時(shí)間(tPNf、t2、t3、t4、t5、t8、tM、tSB、tB)，其中2細(xì)胞到3細(xì)胞的發(fā)育時(shí)間以cc2表示，3細(xì)胞到5細(xì)胞的發(fā)育時(shí)間以cc3表示，3細(xì)胞到4細(xì)胞的發(fā)育時(shí)間以s2表示，5細(xì)胞到8細(xì)胞的發(fā)育時(shí)間以s3表示，同時(shí)觀察胚胎異常分裂行為AC和RC，其中AC1為胚胎第1次卵裂時(shí)1個(gè)細(xì)胞分裂為3個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象，AC2為胚胎除第1次卵裂以外其余各卵裂期1個(gè)細(xì)胞分裂為3個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象。胚胎動(dòng)力學(xué)指標(biāo)包括：tPNf、t2、t3、t4、t5、t8、tM、tSB、tB、cc2、cc3、s2、s3、桑椹胚融合到開始出現(xiàn)囊腔的時(shí)間(tSB-tM)和開始出現(xiàn)囊腔到囊腔充滿整個(gè)透明帶的時(shí)間(tB-tSB)。囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分采用Gardner評(píng)分體系[9]，形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括：囊胚發(fā)育天數(shù)(D5、D6)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)評(píng)分和TE細(xì)胞評(píng)分。由于活檢時(shí)對(duì)胚胎進(jìn)行透明帶打孔，所以未對(duì)活檢囊胚進(jìn)行囊胚擴(kuò)張程度進(jìn)行評(píng)判。

4.囊胚活檢：胚胎培養(yǎng)至第4天在ICM對(duì)側(cè)用透明帶激光打孔器(ZIOS-tk，Hamilton Thorne Bio Sciences，美國(guó))打孔，待≥5個(gè)TE細(xì)胞孵出后進(jìn)行活檢。固定孵出點(diǎn)對(duì)側(cè)位，吸住孵出的TE細(xì)胞，利用牽引力和激光切割取下5～10個(gè)TE細(xì)胞，將TE細(xì)胞置于Gmops plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中漂洗3次后放于PCR小管備用。

5.二代測(cè)序PGT：活檢后的TE細(xì)胞用SurePlex WGA Kit試劑盒(Blue Gnome，美國(guó))進(jìn)行全基因組擴(kuò)增后構(gòu)建文庫。等溫?cái)U(kuò)增和富集后用Ion Pgmtm Template OT2 200 Kit試劑盒(Thermo，美國(guó))對(duì)文庫DNA進(jìn)行擴(kuò)增，數(shù)據(jù)結(jié)果用E&S-胚胎染色體異倍性分析系統(tǒng)[10]分析。

6.囊胚解凍移植：患者自然周期或人工周期處理后進(jìn)行復(fù)蘇周期囊胚移植。優(yōu)先移植整倍體囊胚，若有兩個(gè)或兩個(gè)以上整倍體囊胚，結(jié)合Gardner評(píng)分[9]和KID ScoreTM[11]D3/D5評(píng)分選擇，每次移植1枚囊胚。

7.臨床結(jié)局：移植后14 d測(cè)血β-HCG，β-HCG>10 U/L為陽性，陽性者于36 d后行B超檢查，宮內(nèi)見孕囊者為臨床妊娠。

8.觀察指標(biāo)：各組胚胎動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、形態(tài)學(xué)指標(biāo)和胚胎特殊分裂(AC、RC)形式。整倍體率=整倍體胚胎數(shù)/二代測(cè)序檢測(cè)胚胎數(shù)×100%，種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)(單卵雙胎算1個(gè)孕囊)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、納入患者基本情況

納入患者平均年齡(32.2±5.3)歲，體重指數(shù)(BMI)(21.8±3.0)kg/m2，F(xiàn)SH(7.2±2.1)U/L、E2(184.1±95.5)pmol/L、LH(5.3±3.9)U/L、抗苗勒管激素(AMH)(4.6±4.1)ng/ml、平均獲卵數(shù)(13.9±7.4)枚、成熟卵數(shù)(11.7±6.5)枚、正常受精數(shù)(9.1±5.1)枚、形成可用囊胚數(shù)(5.0±3.5)枚。

二、整倍體組與非整倍體組胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

與非整倍體組比較，整倍體組的tPNf、t2、t3、t4、t5、tM、tSB、tB以及tSB-tM等發(fā)育動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)，而t8、cc2、cc3、s2、s3和tB-tSB等發(fā)育動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

三、種植組和非種植組患者的一般情況

根據(jù)是否種植將整倍體組又分為種植組和非種植組，兩組患者的一般情況比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

四、種植組和非種植組胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

非種植組的tSB-tM顯著低于種植組(P<0.05)，其余各胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

五、形態(tài)學(xué)指標(biāo)和胚胎特殊分裂對(duì)囊胚整倍性及整倍體胚胎種植率的影響

D5囊胚的整倍體率顯著高于D6囊胚(P<0.05)，ICM評(píng)分中A級(jí)囊胚的整倍體率顯著高于B級(jí)、C級(jí)(P<0.05)，TE細(xì)胞評(píng)分A、B、C級(jí)的整倍體率逐級(jí)遞減，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。胚胎特殊分裂(AC和RC)對(duì)囊胚的整倍體率無顯著影響(P>0.05)。胚胎特殊分裂(AC和RC)、囊胚發(fā)育天數(shù)、ICM評(píng)分和TE評(píng)分對(duì)整倍體囊胚的種植率均無顯著影響(P>0.05)(表4)。

表1 整倍體組與非整倍體組胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較[(-±s)，h]

表2 種植組和非種植組患者一般情況比較(-±s)

表3 種植組和非種植組胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 [(-±s)，h]

表4 形態(tài)學(xué)指標(biāo)和胚胎特殊分裂對(duì)囊胚整倍性及整倍體胚胎種植率的影響(%)

討 論

本研究以胚胎整倍性為基礎(chǔ)，從胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)角度出發(fā)，探索可能提高胚胎選擇效率的參數(shù)。研究結(jié)果提示，D5囊胚的整倍體率(46.2%)顯著高于D6囊胚(30.7%)，并且囊胚整倍性隨ICM評(píng)分和TE評(píng)分升高而增高。整倍體胚胎除t8外，從tPNf到tB的所有細(xì)胞分裂時(shí)間點(diǎn)均顯著早于非整倍體胚胎，提示胚胎生長(zhǎng)發(fā)育速度快的囊胚更偏向于整倍體，跟D5活檢囊胚整倍體率較高相呼應(yīng)。本結(jié)論與Barash等[12]的結(jié)果一致，而Capalbo等[13]與Rienzi等[6]均認(rèn)為D5囊胚和D6囊胚的整倍體率無顯著差異。Capalbo等[13]關(guān)于ICM評(píng)分和TE評(píng)分對(duì)整倍體率影響的結(jié)論和本研究相似，認(rèn)為隨著ICM評(píng)分和TE評(píng)分的降低整倍體率顯著降低(P<0.05)。Campbell等[14-15]發(fā)現(xiàn)，tM、tB、透明帶厚度變?yōu)槠湓泻穸纫话氲臅r(shí)間(tEB)均與整倍體性顯著相關(guān)(P<0.05)，并以此建立胚胎選擇模型選擇非植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-A)患者胚胎。盡管我們前期關(guān)于早期胚胎動(dòng)力學(xué)與胚胎發(fā)育潛能的研究表明，cc2、cc3、s2和s3等動(dòng)力學(xué)指標(biāo)以及胚胎特殊分裂(AC和RC)對(duì)于囊胚形成均有顯著影響(P<0.05)，但是這些指標(biāo)對(duì)于囊胚的整倍性卻無顯著影響(P>0.05)，值得注意的是本研究的這幾個(gè)指標(biāo)的值均落在之前研究的優(yōu)質(zhì)胚胎參數(shù)范圍內(nèi)[16]。由此可知，這些指標(biāo)雖然能夠影響早期胚胎的發(fā)育潛能，在卵裂期胚胎選擇中起積極的指導(dǎo)意義，但是當(dāng)卵裂期胚胎形成囊胚后，這些指標(biāo)并不能預(yù)測(cè)囊胚整倍性。Desai等[2]也認(rèn)為胚胎特殊分裂(AC、RC和CC)和胚胎整倍性不相關(guān)，但胚胎特殊分裂(AC和CC)與胚胎發(fā)育潛能相關(guān)，兩種或以上不同分裂異常行為會(huì)導(dǎo)致囊胚整倍體率顯著降低(P<0.05)。我們推測(cè)其原因可能是由于囊胚生長(zhǎng)發(fā)育過程本身就是一個(gè)胚胎篩選過程，胚胎發(fā)育過程中的自我糾錯(cuò)能力，包括異常細(xì)胞的碎片化、桑椹胚形成時(shí)細(xì)胞的不融合和排出等，使得這些原本具有錯(cuò)誤分裂的胚胎得到糾正。Lagalla等[17]研究也證實(shí)胚胎特殊分裂AC可產(chǎn)生整倍體胚胎。

關(guān)于整倍體囊胚種植方面，本研究發(fā)現(xiàn)囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分，即囊胚發(fā)育天數(shù)、ICM評(píng)分和TE評(píng)分并不對(duì)整倍體囊胚的種植力有預(yù)示作用，即選擇形態(tài)學(xué)更優(yōu)質(zhì)的整倍體囊胚并不能提高種植率。Capalbo等[13]也發(fā)現(xiàn)整倍體囊胚的種植率跟囊胚的形態(tài)和生長(zhǎng)速度不相關(guān)，但Nazem等[18]和Zhao等[19]卻認(rèn)為相關(guān)。Kimelman等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在未進(jìn)行整倍體檢測(cè)的囊胚中，D6囊胚的妊娠率和出生率均顯著低于D5囊胚，但是在整倍體囊胚中D6整倍體囊胚的妊娠率和出生率與D5囊胚無顯著差異。因此，我們推測(cè)囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分跟種植率的相關(guān)性可能只是囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分跟胚胎整倍體相關(guān)性的映射。Gazzo等[21]研究發(fā)現(xiàn)，EmbryoscopeTM時(shí)差培養(yǎng)箱的KS5評(píng)分體系可以提高整倍體胚胎的種植率，而本研究發(fā)現(xiàn)tSB-tM與整倍體囊胚的種植率相關(guān)，種植組tSB-tM顯著大于未種植組(P<0.05)，也就是種植的整倍體囊胚從桑椹胚形成到出現(xiàn)囊胚腔的時(shí)間更長(zhǎng)，即當(dāng)評(píng)估整倍體性時(shí)tSB-tM在整倍體囊胚偏向更短，但是在評(píng)估整倍體囊胚的種植時(shí)，該值在種植組胚胎偏向于更長(zhǎng)。即從桑椹胚形成到開始出現(xiàn)囊腔的時(shí)間不能太短也不能太長(zhǎng)，需在一個(gè)特定范圍內(nèi)。桑椹胚到囊胚的發(fā)育過程存在一系列變化，如卵裂球致密化、卵裂球間形成緊密和縫隙連接、大量表面微絨毛和細(xì)胞膜其它成分的重排、胚胎轉(zhuǎn)錄和翻譯過程增強(qiáng)等。細(xì)胞失去全能性，獲得呈放射狀的極性，最終產(chǎn)生兩個(gè)細(xì)胞群，具有表面微絨毛的外極細(xì)胞變成TE，具有緊密聯(lián)系的內(nèi)極細(xì)胞變成ICM。由此推測(cè)這一進(jìn)程發(fā)展的過快或過慢，都可能會(huì)導(dǎo)致某些重要環(huán)節(jié)出錯(cuò)，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育，甚至后續(xù)的臨床結(jié)局。Kramer等[22]研究也發(fā)現(xiàn)桑椹期致密化的持續(xù)時(shí)間和人類胚胎整倍體染色體組成之間存在顯著相關(guān)。另外，本研究由于樣本數(shù)比較少，且種植不僅受胚胎因素影響，還受子宮內(nèi)膜等多種因素影響，究竟tSB-tM是否能夠作為預(yù)測(cè)整倍體囊胚種植潛能的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，我們需謹(jǐn)慎對(duì)待，還需進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

綜上，我們認(rèn)為胚胎發(fā)育時(shí)間點(diǎn)發(fā)生早的，ICM評(píng)分和TE評(píng)分高的D5囊胚其整倍體率較高，但若已知胚胎是整倍體時(shí)，這些形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分裂時(shí)間點(diǎn)不能預(yù)測(cè)種植結(jié)局，而尋找那些從桑椹胚形成到開始出現(xiàn)囊胚腔時(shí)間略長(zhǎng)的整倍體囊胚也許能獲得更好的種植結(jié)局。對(duì)于一般IVF-ET周期，胚胎上述指標(biāo)可作為胚胎優(yōu)選的候選指標(biāo)，提高臨床結(jié)局；對(duì)于PGT-A周期，可利用Time-lapse技術(shù)致力于獲得整倍體胚胎更高的種植率。