丙二酸對銅綠微囊藻的抑制效果

楊超慧，王 超，歐陽萍，甘小蓉

(1.河海大學(xué)淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210098； 3.江蘇省生態(tài)環(huán)境廳，江蘇 南京 210036)

水華暴發(fā)近年來成了發(fā)生頻繁且危害嚴(yán)重的環(huán)境問題。藍(lán)藻聚集成團(tuán)漂浮在水面上，不僅使水體透明度下降，還使水體中溶解氧質(zhì)量濃度降低，導(dǎo)致水生生物窒息而死，破壞生態(tài)環(huán)境[1-3]。此外，藍(lán)藻釋放的藻毒素還會給飲用水源安全帶來威脅[4]，但如何抑制藍(lán)藻生長仍是世界性的難題。目前去除藍(lán)藻的方法主要分為物理法、化學(xué)法及生物法。物理法如機(jī)械打撈[5]、黏土吸附[6]等，雖然能夠在一定程度上緩解藻類暴發(fā)，但是無法從根本上解決問題?；瘜W(xué)法如向水體中投加具有殺藻效用的化學(xué)物質(zhì)[7]等，雖然起效快，但是會對水體造成二次污染。生物法指利用生物間的相互作用來抑制藻類生長，其中，化感抑藻因其高效性和環(huán)境友好性成為了研究熱點(diǎn)?；凶饔弥钢参锿ㄟ^向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)而對另一種植物產(chǎn)生直接或間接影響的現(xiàn)象，這種化學(xué)物質(zhì)，是植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)，被稱為化感物質(zhì)。近年來，關(guān)于利用植物釋放的化感物質(zhì)抑制藻類生長的報(bào)道不斷增多[8]。Zhao等[9]經(jīng)過野外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在水體中種植桉樹能夠有效抑制藻類生長，在試驗(yàn)第30天對藻類的抑制率達(dá)到了85.8%;Wang等[10]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量濃度為2 g/L的人面樹樹葉提取物的作用下，試驗(yàn)第15天時(shí)銅綠微囊藻的葉綠素a質(zhì)量濃度下降了96%?；形镔|(zhì)大體上可以分為14類，包括酚酸類、生物堿、萜類化合物等[11]，由于化感物質(zhì)種類繁多，因此從中選擇能夠高效抑藻的物質(zhì)仍是難點(diǎn)所在。

銅綠微囊藻在高溫、低光照等不利條件下仍能保持較高的生長速率[12-13]，夏季時(shí)在藍(lán)藻競爭中處于優(yōu)勢地位[14]，因此本文選擇銅綠微囊藻作為試驗(yàn)藻種。丙二酸是常見的化感物質(zhì)之一，屬于有機(jī)酸，具有良好的水溶性，常用于醫(yī)藥中間體和香料合成等。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，丙二酸具有抑藻效應(yīng)，由于丙二酸較為常見，價(jià)格低廉，因此本文選擇丙二酸作為抑藻劑，探討它對藍(lán)藻水華中典型藻種銅綠微囊藻的抑制效果，并根據(jù)丙二酸處理后藻細(xì)胞藻膽蛋白質(zhì)量濃度及超微結(jié)構(gòu)的變化分析丙二酸的抑藻機(jī)理，以期為利用丙二酸治理藍(lán)藻水華提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)藻種銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa, FACHB 1343)購自中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫，采用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將藻種置于光照培養(yǎng)箱中于溫度25 ℃，光照強(qiáng)度4 000 lx，光暗比 12 h∶12 h的條件下培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動3～4次。丙二酸為分析純，純度98%，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

a. 丙二酸質(zhì)量濃度對抑藻效果的影響試驗(yàn)。將銅綠微囊藻置于1.1節(jié)所述條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(藻細(xì)胞密度約為105～106個(gè)/mL)后，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果向350 mL藻液中加入丙二酸，使丙二酸質(zhì)量濃度分別為0(對照組)、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和120 mg/L。各試驗(yàn)組和對照組均設(shè)置3個(gè)平行組，在試驗(yàn)第0、1、3、5、8、12天利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下測定藻細(xì)胞數(shù)目，并參照郭亞麗等[15]采用丙酮提取-分光光度法測定藻液葉綠素a的質(zhì)量濃度。

b. 不同丙二酸投加方式對抑藻效果的影響試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算可得丙二酸在試驗(yàn)第3天對銅綠微囊藻的半最大效應(yīng)濃度EC50值，從抑藻效果和投加劑量的方面綜合考慮，后續(xù)試驗(yàn)控制丙二酸濃度為EC50值即73.8 mg/L。向350 mL藻液中投加丙二酸，使丙二酸質(zhì)量濃度達(dá)到73.8 mg/L的投加量25.83 mg作為基礎(chǔ)劑量。設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組 B1～B3，B1組在0 h時(shí)一次性投加25.83 mg的丙二酸，B2組分別在0 h和6 h投加一半基礎(chǔ)劑量即12.92 mg的丙二酸，B3組分別在0 h、3 h、6 h、9 h和12 h投加1/5基礎(chǔ)劑量即5.17 mg的丙二酸。3個(gè)試驗(yàn)組在試驗(yàn)開始12 h后丙二酸質(zhì)量濃度均達(dá)到73.8 mg/L，對照組不投加丙二酸。各試驗(yàn)組和對照組均設(shè)置3個(gè)平行組，在試驗(yàn)第0、1、3、5、8、12天利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下測定藻細(xì)胞數(shù)目，并參照郭亞麗等[15]采用丙酮提取-分光光度法測定藻液葉綠素a質(zhì)量濃度。

c. 丙二酸抑藻機(jī)理研究試驗(yàn)。向350 mL藻液中一次性加入丙二酸，使丙二酸濃度為73.8 mg/L，對照組不添加丙二酸。各試驗(yàn)組和對照組均設(shè)置3個(gè)平行組，在試驗(yàn)第12天參照吳忠興[16]利用反復(fù)凍融法測定藻液藻膽蛋白質(zhì)量濃度，并參照鄧?yán)^選等[17]的方法在掃描電鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

丙二酸對銅綠微囊藻的抑制率計(jì)算公式為

IR=(1-N/N0)×100%

(1)

式中：IR為抑制率，%；N為試驗(yàn)組藻細(xì)胞密度，個(gè)/mL；N0為對照組藻細(xì)胞密度，個(gè)/mL。

抑藻的半最大效應(yīng)濃度EC50通過將丙二酸質(zhì)量濃度與對銅綠微囊藻的抑制率作一元線性回歸方程來計(jì)算。試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3個(gè)平行試驗(yàn)組的平均值，采用Excel 2007和SPSS21.0軟件進(jìn)行處理，對照組與試驗(yàn)組之間采用單因素方差分析，P<0.05說明有顯著性差異，P>0.05說明無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙二酸質(zhì)量濃度對抑藻效果的影響

在不同質(zhì)量濃度的丙二酸作用下，銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度變化趨勢如圖1所示。對照組的藻細(xì)胞密度隨著試驗(yàn)時(shí)間的增長而不斷增大，試驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度較對照組出現(xiàn)下降。當(dāng)丙二酸質(zhì)量濃度小于60 mg/L時(shí)，對銅綠微囊藻的抑制效果較弱，甚至出現(xiàn)促進(jìn)的現(xiàn)象，這與前人研究中化感物質(zhì)的抑藻效用呈現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象一致[18]。但當(dāng)丙二酸質(zhì)量濃度為60 mg/L時(shí)，銅綠微囊藻藻細(xì)胞密度較對照組出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，在試驗(yàn)第12天時(shí)抑制率達(dá)到了87.26%。當(dāng)丙二酸質(zhì)量濃度較高(≥60 mg/L)時(shí)，對銅綠微囊藻的抑制效果隨著丙二酸質(zhì)量濃度的增大而不斷增強(qiáng)。

圖1 不同質(zhì)量濃度丙二酸對銅綠微囊藻藻細(xì)胞密度的影響

圖2為不同質(zhì)量濃度丙二酸對銅綠微囊藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響。如圖2所示，對照組藻液的葉綠素a質(zhì)量濃度隨著試驗(yàn)時(shí)間增長不斷增大，而試驗(yàn)組的葉綠素a質(zhì)量濃度變化趨勢與藻細(xì)胞密度變化趨勢基本一致。當(dāng)丙二酸的質(zhì)量濃度小于 60 mg/L 時(shí)，雖然藻細(xì)胞葉綠素a質(zhì)量濃度略有下降，但下降幅度較小，有時(shí)甚至出現(xiàn)高于對照組的情況。但隨著丙二酸的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，試驗(yàn)組的葉綠素a質(zhì)量濃度較對照組出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)。在試驗(yàn)期間也可以觀察到藻液顏色逐漸變黃，這說明由于葉綠素a質(zhì)量濃度下降，銅綠微囊藻的光合作用受到了抑制。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算可得，在試驗(yàn)第3天時(shí)，丙二酸對銅綠微囊藻抑制作用的EC50值為73.8 mg/L。

圖2 不同質(zhì)量濃度丙二酸對銅綠微囊藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響

2.2 不同丙二酸投加方式對抑藻效果的影響

圖3和圖4分別為在不同丙二酸投加方式的作用下，銅綠微囊藻藻細(xì)胞密度和葉綠素a質(zhì)量濃度的變化。對照組銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度和葉綠素a質(zhì)量濃度隨著試驗(yàn)時(shí)間的增長而不斷增大。與對照組相比，各試驗(yàn)組銅綠微囊藻的生長都受到了抑制，但分批次投加的試驗(yàn)組的抑藻效果明顯差于一次性投加組。當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行到第12天時(shí)，B1組對銅綠微囊藻的抑制率達(dá)到了94%，較對照組出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)。而B2組和B3組此時(shí)的抑制率分別為-87.85%和30.25%，與對照組相比沒有明顯抑制效果，甚至產(chǎn)生了促進(jìn)作用。葉綠素a質(zhì)量濃度的變化與藻細(xì)胞密度的變化趨勢相似。在試驗(yàn)第12天，B1組的葉綠素a質(zhì)量濃度較對照組下降了93.8%，而B2組的葉綠素a質(zhì)量濃度較對照組上升，B3組的葉綠素a質(zhì)量濃度下降幅度較小，這進(jìn)一步說明了一次性投加的方式有利于增強(qiáng)抑藻效果。

圖3 不同丙二酸投加方式對銅綠微囊藻藻細(xì)胞密度的影響

圖4 不同丙二酸投加方式對銅綠微囊藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響

2.3 丙二酸對藻膽蛋白質(zhì)量濃度的影響

添加丙二酸第12天藻液中藻膽蛋白質(zhì)量濃度的變化如表1所示。藻膽蛋白包括藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白等，是銅綠微囊藻重要的捕光蛋白，對光合作用起輔助作用[19]。添加丙二酸后，試驗(yàn)組中藻細(xì)胞的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.05)，較對照組下降了85.31%。但別藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度未出現(xiàn)明顯變化，且藻紅蛋白質(zhì)量濃度略有上升。這說明丙二酸主要通過影響藻藍(lán)蛋白的合成進(jìn)一步阻礙銅綠微囊藻的光合作用，影響銅綠微囊藻的正常生長。

表1 試驗(yàn)第12天丙二酸對銅綠微囊藻藻膽蛋白質(zhì)量濃度的影響

2.4 丙二酸對藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖5為丙二酸對銅綠微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。由圖5可見，在丙二酸的作用下，藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，圖5(b)為丙二酸質(zhì)量濃度73.8 mg/L進(jìn)行處理的試驗(yàn)組。對照組的藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，整體呈球形，而試驗(yàn)組的藻細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞膜發(fā)生明顯凹陷，從而使得胞內(nèi)物質(zhì)溢出，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞。由此可推測，丙二酸通過破壞銅綠微囊藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)使得藻細(xì)胞破裂，造成藻細(xì)胞大量死亡，從而抑制銅綠微囊藻生長。

(a) 對照組

3 討 論

化感物質(zhì)種類繁多，不同化感物質(zhì)對藻類的抑制效果不同。有研究發(fā)現(xiàn)，在賴氨酸和丙二酸的協(xié)同作用下，第21天時(shí)試驗(yàn)水體中的銅綠微囊藻生物量降至對照組的1/6[20]。本研究表明，丙二酸單獨(dú)作用于銅綠微囊藻時(shí)，同樣具有良好的抑制效果。當(dāng)丙二酸質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L時(shí)，在試驗(yàn)第12天對銅綠微囊藻的抑制率達(dá)到了87.26%。經(jīng)過計(jì)算可得，丙二酸在試驗(yàn)第3天對銅綠微囊藻抑制效果的EC50值為73.8 mg/L。張庭延等[21]研究表明水楊酸和肉桂酸在試驗(yàn)第6天對銅綠微囊藻的EC50值分別為64.9 mg/L和89.34 mg/L；楊萌等[22]研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸和阿魏酸乙酯在試驗(yàn)第3天抑制銅綠微囊藻生長的EC50值分別為123.7 mg/L和 87.7 mg/L。比較可得，在相同時(shí)間內(nèi)丙二酸對銅綠微囊藻抑制效果的EC50值較小，這說明與目前所報(bào)道的常見化感物質(zhì)相比，在以達(dá)到相同抑藻效果為目標(biāo)的前提下，利用丙二酸除藻所需投加的丙二酸量較少，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。

影響化感抑藻的因素包括藻的初始密度[23]，化感物質(zhì)濃度[24]、化感物質(zhì)的投加方式[25]等。由于當(dāng)銅綠微囊藻處于對數(shù)生長期，即藻細(xì)胞密度已達(dá)到105～106個(gè)/mL時(shí)，丙二酸仍具有良好的抑藻效果，因此可認(rèn)為利用丙二酸來減緩銅綠微囊藻暴發(fā)具有實(shí)際應(yīng)用意義。研究表明，與分次投加相比，一次性投加丙二酸的試驗(yàn)組的抑藻效果最好，但吳程等[26]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)添加植物種植水的抑藻效果強(qiáng)于一次性投加。這可能是因?yàn)樗参镌谏L過程中會以連續(xù)釋放化感物質(zhì)的方式作用于藻類[27]，但本試驗(yàn)采用了直接投加化感物質(zhì)的方式進(jìn)行研究，因此在初始加入足量丙二酸有利于增強(qiáng)抑藻效果。

目前研究表明，化感物質(zhì)的抑藻機(jī)理主要包括使藻細(xì)胞葉綠素a質(zhì)量濃度降低來阻礙藻類的光合作用[28]、破壞藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)使細(xì)胞完整性遭到破壞[29]、對藻細(xì)胞膜系統(tǒng)造成過氧化損傷[30]、改變藻細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)[31]等。通過對藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)丙二酸能夠破壞銅綠微囊藻藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露，這是導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡的原因之一，這與武赟[32]的研究結(jié)果相似。在丙二酸作用下，不僅藻細(xì)胞的葉綠素a質(zhì)量濃度減少，藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度也出現(xiàn)了明顯下降，因而藻細(xì)胞的捕光功能受到影響，光合活性下降。但吳程等[33]的研究表明，在添加水生植物種植水后，不僅集胞藻藻細(xì)胞中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度出現(xiàn)明顯下降，別藻藍(lán)蛋白合成也受到阻礙。這說明藻細(xì)胞的捕光功能團(tuán)對不同化感物質(zhì)的敏感程度不同，但藻膽蛋白是化感物質(zhì)作用于藻細(xì)胞的重要位點(diǎn)。但是本文并未測定藻細(xì)胞中過氧化酶質(zhì)量濃度的變化，后續(xù)試驗(yàn)可以針對丙二酸對銅綠微囊藻細(xì)胞中酶合成的影響做進(jìn)一步研究，以完善丙二酸的抑藻機(jī)理。

4 結(jié) 論

a. 丙二酸能夠顯著抑制銅綠微囊藻的生長，且抑制效果與丙二酸質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)丙二酸質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L時(shí)，對銅綠微囊藻的抑制效果隨著濃度的增大而增強(qiáng)。在試驗(yàn)第12天，質(zhì)量濃度為60 mg/L的丙二酸處理組對銅綠微囊藻的抑制率為87.26%。

b. 丙二酸通過引起銅綠微囊藻葉綠素a及藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度下降的方式來阻礙藻細(xì)胞的光合作用。同時(shí)，丙二酸能夠破壞藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使胞內(nèi)物質(zhì)外泄，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。

c. 一次性投加丙二酸較分批投加而言對銅綠微囊藻的抑制效果更強(qiáng)，因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)采用一次性投加丙二酸的方式來治理藍(lán)藻水華。