UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)食品中3 種主要牛奶過(guò)敏原

寧亞維，劉 茁，楊 正，馬俊美，范素芳，李 強(qiáng),*，張 巖,*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000）

近年來(lái)，食物過(guò)敏在世界范圍內(nèi)迅速增加，已經(jīng)成為一個(gè)備受關(guān)注的國(guó)際公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。牛奶過(guò)敏是常見(jiàn)的食物過(guò)敏之一，發(fā)病率在人群中分布廣泛，約0.3%～7.5%[2]。尤其是2 歲以下兒童發(fā)病率最高，這可能與嬰幼兒長(zhǎng)期接觸以牛乳為原料的配方奶粉有關(guān)[3-4]。而牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富是食品加工中常用的原輔料，不同食品間共用生產(chǎn)線的不充分清潔會(huì)增加交叉接觸的可能性，增大過(guò)敏人群的暴露風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此許多國(guó)家已經(jīng)制定了食品過(guò)敏原強(qiáng)制標(biāo)識(shí)法規(guī)，以保護(hù)消費(fèi)者免受食品過(guò)敏侵害[5-7]，某些特定產(chǎn)品中已經(jīng)有“無(wú)牛奶”標(biāo)簽[4,8]。而目前我國(guó)過(guò)敏原研究尚處于初始階段，僅在GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》和GB/T 23779—2009《預(yù)包裝食品中的致敏原成分》中推薦企業(yè)自行標(biāo)識(shí)以提醒消費(fèi)者[9-11]。因此，為降低牛奶過(guò)敏消費(fèi)者的健康隱患，促進(jìn)過(guò)敏原標(biāo)識(shí)規(guī)范化和保障我國(guó)加工食品的出口貿(mào)易，建立可靠、靈敏的檢測(cè)方法十分必要。

目前，用于牛奶過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[12-14]法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[15-17]法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[18-20]法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）[5,21-22]法。目前，ELISA方法最為成熟，但由于各式各樣的食品熱加工手段會(huì)破壞目標(biāo)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使目標(biāo)致敏蛋白不能被特異性抗體識(shí)別，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果[23]。而PCR法是對(duì)致敏蛋白的DNA進(jìn)行間接檢測(cè)，不受加工方式的影響，但核酸提取過(guò)程繁瑣，易發(fā)生污染出現(xiàn)假陽(yáng)性。相比于傳統(tǒng)的PCR法，新興的LAMP法不僅簡(jiǎn)化了復(fù)雜的操作流程，還可以達(dá)到更高的靈敏度，但仍面臨擴(kuò)增產(chǎn)物易污染的問(wèn)題[24-25]，且不能對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的多種過(guò)敏原進(jìn)行高通量檢測(cè)。近年來(lái)，LC-MS法被廣泛應(yīng)用于牛奶過(guò)敏原的檢測(cè)[4,26-28]，可以有效解決ELISA的假陰性及PCR的假陽(yáng)性弊端，如Lamberti等[4]采用質(zhì)譜法檢測(cè)餅干中的αs1-酪蛋白，定量限（limit of quantitation，LOQ）為4 μg/g；Lai Shiyun等[27]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法檢測(cè)奶制品中的α-乳白蛋白，LOQ為50 μg/g；Zhang Jingshun等[28]采用UPLC-MS/MS法檢測(cè)奶制品中的乳鐵蛋白，LOQ為3 μg/g。但其忽略了單一致敏蛋白在加工過(guò)程中熱變性或定量限等問(wèn)題造成的假陰性。

基于質(zhì)譜技術(shù)高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)擬篩選牛奶過(guò)敏原β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的特征肽段，開(kāi)發(fā)一種UPLC-MS/MS法對(duì)食品中的β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，以期為食品中牛奶過(guò)敏原的標(biāo)簽監(jiān)管和準(zhǔn)確定量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面粉、配料中含牛奶和不含牛奶的8 種樣品 市售。

TPEVDDEALEK（96.69%）、VLVLDTDYK（97.26%）、YLGYLEQLLR（98.80%）、HQGLPQEVLNENLLR（95.83%）、FFVAPFPEVFGK（97.33%）、TVYQHQK（96.99%）、FALPQYLK（95.68%）、NAVPITPTLNR（99.91%） 上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；β-乳球蛋白（90%，來(lái)源于牛乳）、α-酪蛋白（70%，來(lái)源于牛乳）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸氫銨、甲酸（均為質(zhì)譜純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；正己烷、乙腈（均為質(zhì)譜純） 美國(guó)Fisher Scientific公司；TPCK-胰蛋白酶（生物級(jí)） 美國(guó)AB SCIEX公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為Watsons蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾離心管（0.5 mL，10 kDa）、Easy-nLC 1000-Q Exactive納升液相色譜-串聯(lián)軌道阱高分辨質(zhì)譜 美國(guó)Thermo Scientific公司；UPLC-Triple Quad 6500＋超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（配電噴霧離子源及MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)AB SCIEX公司；C18毛細(xì)富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）、C18毛細(xì)分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?） 北京樂(lè)潤(rùn)峰科技有限公司；Proteonavi色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm） 日本Shiseido公司。

1.3 方法

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制

精密稱取TPEVDDEALEK、VLVLDTDYK、YLGYLEQLLR、HQGLPQEVLNENLLR、FFVAPFPEVFGK、TVYQHQK、FALPQYLK、NAVPITPTLNR各1 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成100 μg/mL的特征肽段混標(biāo)儲(chǔ)備液。再分別稱取22.22 mgβ-乳球蛋白、28.57 mgα-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備液。其中α-酪蛋白包括αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，且其含量比為4∶1。

1.3.2 樣品前處理

采用正己烷對(duì)富含脂肪的食品基質(zhì)進(jìn)行脫脂處理，取0.1 g樣品用蒸餾水稀釋至10 mL，取500 μL樣品稀釋液加入10 μL 500 mmol/L DTT溶液混勻，于70 ℃水浴反應(yīng)30 min，然后加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液于室溫下避光靜置30 min。向上述混合液中加入420 μL 500 mmol/L NH4HCO3溶液和30 μL 200 μg/mL TPCK-胰蛋白酶溶液混勻，于37 ℃水浴振搖酶解過(guò)夜，最后加入10 μL甲酸混勻以終止反應(yīng)。酶解液于13 000×g離心10 min，取500 μL上清液于10 kDa超濾管中，14 000×g離心20 min，再取200 μL濾液于樣品瓶中待測(cè)。

1.3.3 設(shè)備參數(shù)

1.3.3.1 Easy-nLC 1000-Q Exactive測(cè)定條件

色譜條件：富集柱：C18毛細(xì)色譜柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）；分析柱：C18毛細(xì)色譜柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫程序：0～3 min，97%～93% A，3%～7% B；3～38 min，93%～78% A，7%～22% B；38～48 min，78%～65% A，22%～35% B；48～50 min，65%～10% A，35%～90% B；50～60 min，10% A，90% B；流速300 nL/min；進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電離源為電噴霧（正離子）離子源；掃描模式為Full MS/dd-MS2；全掃描分辨率70 000，AGC target為1×106，掃描范圍m/z350～1 800；dd-MS2分辨率17 500，AGC target為1×105，隔離窗口為m/z2.0，F(xiàn)ixed first mass為m/z120.0，碰撞能為27 eV。Thermo Proteome Discoverer 1.4軟件相關(guān)參數(shù)：蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（bovine）從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行下載（http://www.uniprot.org）；MS1質(zhì)量范圍350～5 000 Da；最小峰數(shù)為1；水解酶為胰蛋白酶；允許漏切位點(diǎn)最多為2；肽段長(zhǎng)度6～144；母離子質(zhì)量誤差±10-6Da；碎片離子質(zhì)量誤差±0.02 Da。

1.3.3.2 UPLC-Triple Quad 6500＋測(cè)定條件

色譜條件：色譜柱：Proteonavi（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫程序：0～2 min，90% A，10% B；2～5 min，90%～80% A，10%～20% B；5～9 min，80%～78% A，20%～22% B；9～13 min，78%～70% A，22%～30% B；13～18 min，70%～25% A，30%～75% B；18～22 min，25% A，75% B；22～22.01 min，25%～90% A，75%～10% B；22.01～25 min，90% A，10% B；流速300 μL/min；進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（正離子）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；離子化電壓5 500 V；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度500 ℃。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.4.1 線性、LOD和LOQ

選擇面粉作為空白基質(zhì)，向其中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使其理論蛋白系列質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000、30 000 ng/mL。以特征肽段的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）得到線性回歸方程。在空白基質(zhì)中，添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備液，獲得定量特征肽段信噪比為3時(shí)，作為其對(duì)應(yīng)過(guò)敏原蛋白的檢出限（limit of detection，LOD）；定量特征肽段信噪比為10時(shí)，作為其對(duì)應(yīng)過(guò)敏原蛋白的LOQ，以μg/g表示。

1.3.4.2 基質(zhì)效應(yīng)

分別精密移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備液，用水稀釋配制，使其理論蛋白系列質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000、30 000 ng/mL。

基質(zhì)效應(yīng)按下式計(jì)算：

式中：slopematrix為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；slopestandard為水溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3.4.3 加標(biāo)回收率與精密度

向空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備液進(jìn)行回收率測(cè)定，β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的具體添加量為25、100、500、5 000 ng/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置6 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）以評(píng)估方法精密度。為排除基質(zhì)對(duì)3 種過(guò)敏原蛋白定量產(chǎn)生的影響，標(biāo)準(zhǔn)曲線均采用添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的空白基質(zhì)酶解液進(jìn)行配制。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

回歸方程及相關(guān)系數(shù)采用MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算得出；色譜圖即為Analyst軟件原始提取離子流圖；采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽段的篩選

牛奶中包括3.5%的蛋白質(zhì)，主要分為兩大類：約占總蛋白質(zhì)80%的酪蛋白和占20%的乳清蛋白[21]，其中含量豐富的α-酪蛋白（αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白）和β-乳球蛋白被認(rèn)為牛奶的主要過(guò)敏原成分[24,29]。且研究數(shù)據(jù)表明，IgE介導(dǎo)的牛奶過(guò)敏中60%的病人是對(duì)β-乳球蛋白過(guò)敏[30]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白作為牛奶過(guò)敏原檢測(cè)的研究對(duì)象，其氨基酸序列見(jiàn)圖1。

圖1 β-乳球蛋白（A）、αs1-酪蛋白（B）和αs2-酪蛋白（C）氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequences of β-lactoglobulin (A), αs1-casein (B) and αs2-casein (C)

表1 牛奶過(guò)敏原鑒定所得全部肽段信息Table 1 Information about all peptides derived from milk allergens

β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)胰蛋白酶酶解后，采用Easy-nLC 1000-Q Exactive進(jìn)行分析。結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，將所得譜圖信息利用Thermo Proteome Discoverer 1.4軟件鑒定匹配。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，3 種標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液所得肽段信息見(jiàn)表1，β-乳球蛋白8 條肽段，肽段覆蓋率為40.4%；αs1-酪蛋白12 條，肽段覆蓋率為51.9%；αs2-酪蛋白13 條肽段，肽段覆蓋率為56.3%。然后根據(jù)以下特征肽段的篩選原則篩選特征肽段：肽段長(zhǎng)度以7～20 個(gè)氨基酸為宜，肽段長(zhǎng)度少于7 個(gè)氨基酸很難滿足其特異性，而長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)不僅在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中易于斷裂且合成價(jià)格昂貴[26]；不含漏切或錯(cuò)切的酶切位點(diǎn)，以保證肽段良好的可重復(fù)性；最好不含甲硫氨酸，因其易被氧化修飾[28]；進(jìn)行定性定量分析時(shí)，具有較好的靈敏度和峰形[31-33]；經(jīng)BLAST搜索后具有特異性。最終篩得8 條特征肽段，他們分別是β-乳球蛋白的VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK；αs1-酪蛋白的FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNENLLR和YLGYLEQLLR；αs2-酪蛋白的NAVPITPTLNR、FALPQYLK和TVYQHQK。

2.2 反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)優(yōu)化

將8 條特征肽段混標(biāo)儲(chǔ)備液用水稀釋至5 000 ng/mL，通過(guò)蠕動(dòng)泵以5 μL/min的速率直接注入Triple Quad 6500＋質(zhì)譜儀中，通過(guò)全掃描模式確定特征肽段的前體離子精確質(zhì)量數(shù)，再通過(guò)產(chǎn)物離子掃描從產(chǎn)物離子中選擇2 個(gè)穩(wěn)定且靈敏度高的特征子離子，以建立MRM離子對(duì)。在MRM模式下優(yōu)化各特征肽段的去簇電壓和碰撞能，見(jiàn)表2、圖2。根據(jù)各肽段靈敏度的高低，分別將VLVLDTDYK、FFVAPFPEVFGK和NAVPITPTLNR作為β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的定量肽段。

表2 牛奶過(guò)敏原特征肽段的MRM參數(shù)Table 2 MRM parameters of signature peptides derived from milk allergens

圖2 牛奶過(guò)敏原8 條特征肽段的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of eight signature peptides derived from milk allergens

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)

表3 牛奶過(guò)敏原定量特征肽段的線性關(guān)系Table 3 Linear calibration equations for quantitative analysis of signature peptides derived from milk allergens

表4 3 種牛奶過(guò)敏原的LOD、LOQ和基質(zhì)效應(yīng)Table 4 LODs, LOQs and matrix effects of three milk allergens

牛奶過(guò)敏原β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白在面粉基質(zhì)中的線性關(guān)系見(jiàn)表3，其在1.6～30 000 ng/mL的線性范圍內(nèi)線性良好，R2均大于0.999。由表4可知，β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白LOQ分別為50、3.2 μg/g和40 μg/g。此外，由表4可得β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白在面粉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)分別為90.54%、86.04%和97.48%，均有不同程度的離子減弱作用，但并不明顯，均在20%以內(nèi)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

傳統(tǒng)ELISA線性范圍窄，故實(shí)際樣品需要稀釋后再進(jìn)行定量，但Monaci等[34]研究表明稀釋對(duì)ELISA法定量牛奶過(guò)敏原有顯著影響，此外Koeberl等[35]選取3 種市售ELISA試劑盒檢測(cè)羽扇豆，結(jié)果表明陽(yáng)性樣品的假陰性率為50%、12.5%和33.3%，陰性樣品的假陽(yáng)性率為33.3%、16.6%和25%，證明ELISA檢測(cè)方法的交叉反應(yīng)及不準(zhǔn)確性。PCR技術(shù)從DNA水平可有效解決復(fù)雜基質(zhì)中帶來(lái)的檢測(cè)困難，但Villa等[15]研究基于β-乳球蛋白基因分別采用定性PCR和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)肉制品中牛奶過(guò)敏原，結(jié)果缺乏可重復(fù)性，LOD高達(dá)500 μg/g；賈敏等[17]基于GenBank基因建立實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)α-乳白蛋白，液體樣品LOD為1 000 copies/mL，但在實(shí)際樣品果粒奶優(yōu)中無(wú)擴(kuò)增曲線，尚不滿足痕量檢測(cè)。與此同時(shí)，以上方法均未涉及多重過(guò)敏原的同時(shí)檢測(cè)，而基于質(zhì)譜技術(shù)的檢測(cè)方法，從特異性的肽段水平進(jìn)行定量，準(zhǔn)確性和靈敏度更高，但目前仍大多局限于單一牛奶過(guò)敏原的定量檢測(cè)，如Lamberti等[4]檢測(cè)餅干中的αs1-酪蛋白，LOQ為4 μg/g；Lai Shiyun等[27]檢測(cè)奶制品中的α-乳白蛋白，LOQ為50 μg/g。而本方法可以有效同時(shí)定量3 種牛奶過(guò)敏原，三者可以相互輔助定性牛奶成分的存在，LOQ最低為3.2 μg/g，可以對(duì)食品中的痕量牛奶過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.2 加標(biāo)回收率與精密度結(jié)果

表5 牛奶過(guò)敏原的加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 5 Recoveries and RSDs of milk allergens from spiked samples (n= 6)

由表5可知，β-乳球蛋白的平均回收率在86.41%～97.59%之間，RSD不大于4.96%；αs1-酪蛋白的平均回收率在87.34%～98.60%之間，RSD不大于4.31%；αs2-酪蛋白的平均回收率在86.98%～92.76%之間，RSD不大于8.95%。相比于Qi Kailun等[36]采用LC-MS法在空白焙烤食物基質(zhì)中αs1-酪蛋白平均回收率在65.2%～71.5%之間，αs2-酪蛋白的平均回收率在79.6%～86.1%之間，可見(jiàn)本方法回收率更加穩(wěn)定，重復(fù)性高，可作為實(shí)際樣品的準(zhǔn)確定量檢測(cè)方法。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

為評(píng)估本實(shí)驗(yàn)所建方法的實(shí)用性，從當(dāng)?shù)爻须S機(jī)選取8 種實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中薯片、奶茶粉、小洋人和早餐包標(biāo)簽信息中含有牛奶但無(wú)過(guò)敏原標(biāo)簽提示，沙琪瑪、蛋黃派、餅干和面粉標(biāo)簽信息中未標(biāo)明含有牛奶成分且無(wú)過(guò)敏原提示。如表6所示，標(biāo)簽信息中含有牛奶成分的4 個(gè)樣品均成功檢出β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，含量范圍分別為（5.502×102±9.451）～（2.402×103±132.4）、（4.917×102±3.484）～（1.003×104±199.1） μg/g和（2.998×102±5.053）～（3.398×103±31.47） μg/g，而不含牛奶的4 個(gè)樣品中3 種過(guò)敏原均未檢出。雖然結(jié)果并未檢出產(chǎn)品中潛在的牛奶過(guò)敏原，但不同生產(chǎn)線間的交叉污染現(xiàn)象仍不容輕視，而本方法可有效保障消費(fèi)者食品安全，為企業(yè)的自檢提供技術(shù)支持，使其可自行標(biāo)明其可能隱藏的過(guò)敏原成分，促進(jìn)食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)市場(chǎng)監(jiān)管的進(jìn)一步落實(shí)和強(qiáng)化。

表6 UPLC-MS/MS法檢測(cè)市售食品中牛奶過(guò)敏原含量Table 6 Contents of milk allergens in commercial foods determined by UPLC-MS/MS

3 結(jié) 論

基于β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的特征肽段，建立UPLC-MS/MS方法，在MRM模式下可用于快速篩查和定量食品中的牛奶過(guò)敏原。本方法通過(guò)同時(shí)檢測(cè)3 種主要的牛奶過(guò)敏原判斷食品中牛奶的存在，避免單一致敏蛋白在加工中的降解及定量限等因素導(dǎo)致的假陰性，LOQ分別為β-乳球蛋白50 μg/g、αs1-酪蛋白3.2 μg/g、αs2-酪蛋白40 μg/g。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本方法良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可為我國(guó)牛奶過(guò)敏原的標(biāo)簽標(biāo)識(shí)管理及定量檢測(cè)提供技術(shù)支持，還可為其他過(guò)敏原的高通量檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)。