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    蛹蟲草中新化合物的分離純化、結構鑒定及抗腫瘤活性

    2021-05-19 07:05:42劉健華王超然沈建福
    食品科學 2021年8期
    關鍵詞:提液核苷蟲草

    項 婷,夏 琛,劉健華,王超然,沈建福,*

    (1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,天然產物與人類健康研究中心,浙江 杭州 310058;2.浙江晟泰茶油科技有限公司,浙江 常山 324200;3.中國科學院大連化學物理研究所,遼寧 大連 116023;4.中科院大化所中國醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院,江蘇 泰州 225300)

    蛹蟲草(Cordyceps militaris(L.) Link),又名北蟲草,是蛹蟲草菌侵染昆蟲蛹或接種在人工培養(yǎng)基上所形成的子實體,隸屬于子囊菌門(Ascomycota)、蟲草屬(Cordyceps),是一種具有廣泛食藥用價值的真菌[1]。早在1986年,中國科學院就已經實現(xiàn)了蛹蟲草的人工培育,與資源稀缺、產量低、價格高昂的野生型冬蟲夏草相比,蛹蟲草不僅克服了地域限制,而且同樣含有多糖、有機酸、蛋白質、核苷、甾醇、無機元素、維生素等多種化學成分,具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤[2]、免疫調節(jié)、神經保護、增強抗氧化活性、改善腸道損傷[3]等多種生物學功效,因此,人工培育的蛹蟲草已經逐漸成為野生型冬蟲夏草優(yōu)良的替代品[4],應用開發(fā)前景極為廣泛。

    蛹蟲草中最具有代表性的成分是核苷類物質,根據堿基不同,可將其分為嘌呤核苷和嘧啶核苷兩大類,母核分別為胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及腺嘌呤、鳥嘌呤等[5]。朱麗娜等[6]運用高效液相分析法建立了蛹蟲草中16 種核苷類成分的指紋圖譜,包括胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、脫氧鳥苷、胸苷、腺苷、蟲草素、2′-脫氧腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷。大量研究表明,腺苷及其衍生物具有鎮(zhèn)靜、改善睡眠質量[7]、改善血脂和氧化還原能力、改善慢性腎臟疾病[8]、緩解神經炎癥[9]、抗菌[10]、神經保護[11]以及廣譜的抗腫瘤作用[12-16]。迄今,針對蛹蟲草中核苷類物質的研究主要圍繞蟲草素和腺苷展開,而對于其他核苷類衍生物,例如氨基酸核苷衍生物的研究則較少,因此,深入挖掘蛹蟲草中此類核苷衍生物,對于豐富蛹蟲草中核苷類物質的數據庫具有重要意義。

    目前,分離純化蛹蟲草中核苷類物質的方法主要有大孔吸附樹脂法[17]、離子交換樹脂法、硅膠柱層析法[18]和制備液相色譜分離技術[19]等。離子交換樹脂法操作過程繁瑣;硅膠柱層析法吸附容量和回收率較低,并且需要大量的有機溶劑[20];大孔吸附樹脂色譜法雖然價格低廉、穩(wěn)定性高、易于再生,但是通常難以一步制備即達到較高純度,需要與其他純化方法聯(lián)合使用。上述傳統(tǒng)的分離方法,柱效低、分離能力差,適用于前處理、粗分離以及少數化合物的獲得。制備液相色譜具有較強的分離能力,可根據物質的性質和液相色譜分析方法選擇合適的柱填料和分離制備的方法,且能實現(xiàn)結構較類似的天然產物分離,但對于分子質量小、極性大的核苷類化合物而言,在反相色譜中保留很弱,是液相色譜分離分析中的難點。

    在研究過程中發(fā)現(xiàn),普通C18液相色譜柱對腺苷和蟲草素的保留與分離較好,但在死時間附近,仍有不少成分共流出。為研究這類“不保留”的物質,本實驗采用了一種極性共聚鍵合的色譜填料[21],利用其耐純水的特性和增強的極性選擇性,成功實現(xiàn)了多個化合物的保留與分離,其中包括蟲草素、腺苷以及兩種單體化合物。利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-offlight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)、核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)法對所得的兩種單體化合物進行結構鑒定,并通過噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法比較蟲草素和兩種單體化合物的抗腫瘤活性。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    蛹蟲草 杭州中非生物科技有限公司。

    蟲草素標準品(純度≥95.5%)、腺苷標準品(純度≥99.7%) 中國食品藥品檢定研究院;三氟乙酸(色譜級,純度≥99.5%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(HPLC級,99.9%) 美國TEDIA有限公司;醋酸(純度≥99.5%) 國藥集團化學試劑有限公司;有機溶劑均為國產分析純。

    HepG2肝癌細胞購自于中國科學院上海細胞庫。

    基本培養(yǎng)基(DMEM/High Glucose,含丙酮酸鈉)康寧公司;胎牛血清(南美胎牛血清) 美國Gibco公司;胰酶(含乙二胺四乙酸)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS) 杭州科易生物技術有限公司;青霉素-鏈霉素混合液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、MTT溶液(5 mg/mL) 北京索萊寶科技有限公司。

    1.2 儀器與設備

    Alliance高效液相色譜儀(配有e2695高效液相色譜泵和二極管陣列檢測器) 沃特世科技(上海)有限公司;Newstyle NP7000 SERIALS制備液相色譜(配有高壓輸液泵Newstyle NP7000 SERIALS PUMP和紫外-可見光檢測器Newstyle NU3000 SERIALS UV/VIS DETECTOR,UV 260 nm) 江蘇漢邦科技有限公司;C18分析型色譜柱(4.6 mm×2.5 mm,5 μm,100 ?)、XCharge C18分析型色譜柱(4.6 mm×2.5 mm,5 μm,100 ?)、C18-HCE制備型色譜柱(50 mm×250 mm,10 μm)、C18制備型色譜柱(50 mm×230 mm,10 μm)北京華譜新創(chuàng)科技有限公司;超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用儀 安捷倫科技(中國)有限公司;600兆超導核磁共振光譜儀 布魯克(北京)科技有限公司;Forma 3111型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)美國賽默飛世爾科技有限公司;生物超凈工作臺 蘇州蘇凈安泰有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 蛹蟲草中活性物質的提取、分離與純化

    1.3.1.1 蛹蟲草粗提液的制備

    參考于戈等[22]的方法,并根據預實驗的結果作適當修改。蛹蟲草經真空冷凍干燥機干燥48 h,用粉碎機粉碎,過40 目篩,制成蛹蟲草粉末,-18 ℃避光密封儲存,備用。準確稱取蛹蟲草凍干粉末127.74 g,按照料液比1∶30(g/mL)加入體積分數為1%的醋酸溶液,40 ℃恒溫水浴,攪拌提取40 min,真空抽濾,收集濾液和濾渣。濾渣進行二次提取,合并2 次提取所得濾液,減壓濃縮,最終得到蛹蟲草粗提液。

    1.3.1.2 蛹蟲草粗提液的分離制備

    參考Zhang Yan等[23]的方法,對蛹蟲草粗提液進行一維和二維分離制備。

    一維制備:C18制備柱(50 mm×230 mm,10 μm),流速60 mL/min,上樣量50 mL,甲醇-超純水(15∶85,V/V),等度洗脫,據譜圖出峰情況,收集各餾分,減壓濃縮,得到一維制備各餾分的濃縮液。

    二維制備:C18-HCE制備柱(50 mm×250 mm,10 μm),流速50 mL/min,洗脫時間0~40 min,甲醇0%~90%,超純水100%~10%,梯度洗脫,據譜圖出峰情況,收集各餾分,減壓濃縮,得到二維制備各餾分的濃縮液。

    1.3.2 高效液相色譜分析蛹蟲草粗提液及其純化組分

    1.3.2.1 蟲草素-腺苷混合標準曲線的建立

    參照農業(yè)農村部標準規(guī)定的方法[24],并適當修改。準確稱取蟲草素和腺苷標準品各3.00 mg,分別用甲醇-水(含0.5% CF3COOH)(5∶95,V/V)溶解并定容至25 mL,作為蟲草素和腺苷的標準儲備液,質量濃度為120 μg/mL,4 ℃保存,有效期1 個月。分別取等體積腺苷和蟲草素的標準儲備溶液互溶,進行梯度稀釋,得到腺苷-蟲草素混合標準溶液,按1.3.2.2節(jié)中的方法進行測定。以腺苷-蟲草素混合標準溶液質量濃度(μg/mL)為X軸,峰面積為Y軸,繪制腺苷-蟲草素混合標準曲線?;貧w方程分別為:腺苷Y=57 279X-13 421,R2=0.999 9;蟲草素Y=52 660X-4 281,R2=1,結果表明:腺苷和蟲草素的質量濃度在1.875~120 μg/mL范圍內均呈良好的線性關系。

    1.3.2.2 高效液相色譜分析[24]

    樣品處理:取蛹蟲草粗提濃縮液、二維制備各餾分濃縮液、腺苷-蟲草素系列梯度的混標溶液各1 mL,過0.45 μm濾膜,用于高效液相色譜分析。

    色譜條件:Alliance高效液相色譜儀;色譜柱:C18(4.6 mm×2.5 mm,5 μm,100 ?)、XCharge C18(4.6 mm×2.5 mm,5 μm,100 ?);流速:0.6 mL/min;紫外檢測器波長260 nm;柱溫:(35±5)℃;進樣量:10 μL;洗脫條件:0~30 min,甲醇0%~10%,超純水(0.5% CF3COOH)100%~90%,梯度洗脫。

    測定:按照保留時間進行定性分析,樣品與標準品保留時間的相對偏差不大于2%。按照標準曲線計算樣品粗提溶液中腺苷、蟲草素等物質的含量及最終得率。

    式中:m為各純化組分凍干粉末的質量/g;m0為蛹蟲草樣品粉末的質量/g。

    1.3.3 結構鑒定

    對分離純化得到的兩種單體化合物(即圖2a中5、6號峰),利用UPLC-Q-TOF MS、NMR法并結合相關的文獻確定其化學結構式。

    1.3.4 MTT法測細胞活力

    采用MTT法檢測各個組分對HepG2肝癌細胞活力的影響,參照文獻[25]方法測定,細胞相對活力的計算方法如式(2)所示:

    式中:OD1為樣品組的吸光度;OD0為空白對照組的吸光度。

    1.4 數據處理

    2 結果與分析

    2.1 高效液相色譜分析蛹蟲草的粗提物

    分別使用C18和C18-HCE兩種液相分析型色譜柱,分析蛹蟲草粗提液和腺苷-蟲草素混合標準溶液,根據色譜結果選擇對各組分分離效果較好的色譜柱作為后續(xù)實驗的分析柱,結果如圖1、2所示。

    由圖1a可知,在260 nm條件下,蛹蟲草粗提液中分離度較大的組分僅有3 種,出峰時間主要集中在10~25 min,對照圖1b可知其中兩種組分分別為腺苷和蟲草素,而樣品中的其他成分的出峰時間大多集中在5 min左右,保留明顯較弱,難以實現(xiàn)有效的分離純化。

    圖1 C18色譜柱的高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms on C18 column

    圖2 C18-HCE色譜柱的高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms on C18-HCE column

    而在C18-HCE分析型液相色譜柱上(圖2),蛹蟲草粗提液中的成分能夠較均勻分布在16~33 min的保留時間范圍內,且可清晰識別6 個含量較高的色譜峰,對照標準品可知1、4號峰分別為腺苷和蟲草素,有5 個色譜峰保留均比腺苷強,由此可見,C18-HCE分析型液相色譜柱對蛹蟲草粗提液中各組分具有較好的選擇性和分離效果[26]。經高效液相色譜法驗證,5、6號峰即為普通C18分析型液相色譜柱中“不保留”的物質。

    2.2 高效液相色譜分析分離制備所得的化合物

    蛹蟲草粗提液先后經C18和C18-HCE制備型液相色譜柱分離制備,得到了除腺苷和蟲草素以外的2 種未知化合物,經高效液相色譜驗證,確證兩者即為圖2a中的5、6號峰,暫且將其命名為化合物I和化合物II。根據各組分的高效液相色譜圖(圖3)可知,腺苷、蟲草素、化合物I和化合物II的出峰時間分別為17.737、22.850、30.013 min和31.075 min。在260 nm條件下,4 種純化組分的HPLC純度分別為90.49%、98.11%、96.34%和98.33%,經冷凍干燥后獲得凍干粉末,根據式(1)計算各組分得率分別為0.053%、0.253%、0.368%和0.231%。采用核磁共振技術進一步對化合物I和化合物II進行結構鑒定。

    圖3 經過二維制備后的4 種純化組分在260 nm波長處的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of the two purified components from two-dimensional preparation at 260 nm

    2.3 未知單體化合物的結構鑒定

    通過UPLC-QTOF MS、NMR并結合相關文獻確定化合物I和化合物II的結構。

    化合物I,是一種淺黃色粉末,經正、負離子模式UPLC-QTOF MS測定,m/z438.217 3[M+H]+(計算值438.213 5)、m/z436.204 4[M-H]+(計算值436.213 5),得出分子式為C17H27N9O5,不飽和度為9。由圖4A可知,1H-NMR(600 MHz,DMSO-D6)δ8.51(s, 1H),8.42(s, 1H),8.23(s, 2H),8.15(s, 1H),7.34(s, 2H),5.97(m, 2H),5.41(s, 2H),4.52(m, 2H),4.02(s, 1H),3.72(dd,J=12.2, 2.1 Hz, 1H),3.61(t,J=6.0 Hz, 1H),3.53(dd,J=12.3, 4.1 Hz, 1H),2.93(dd,J=12.6, 6.5 Hz, 2H),1.64(m, 2H),1.35(m, 2H),1.29(m, 2H)。由圖4B可知,13C-NMR(151 MHz,DMSO)δ171.42、158.80、156.12、152.60、148.87、139.12、119.14、89.46、83.10、73.19、60.94、53.02、50.56、40.06、32.19、29.76、22.04。

    圖4 化合物I的1H-NMR(A)和13C-NMR(B)譜圖Fig. 4 1H-NMR (A) and 13C-NMR (B) spectra of compound I

    化合物II:是一種深黃色粉末,經正、負離子模式UPLC-QTOF MS測定,m/z423.223 7 [M-NH+2H]+(計算值423.234 3)、m/z300.044 9 [MC5H2N5-H]+(計算值300.190 7),得出分子式為C17H28N10O4,不飽和度為9。由圖5A可知,1H-NMR(600 MHz,DMSO)δ8.53(s, 1H),8.42(s, 2H),8.30(s, 3H),8.15(s, 1H),7.54(s, 3H),7.34(s, 2H),5.97(s, 1H),4.51(m, 1H),4.49(m, 1H),4.01(s, 1H),3.71(dd,J=12.2, 2.1 Hz, 1H),3.53(dd,J=12.3, 4.1 Hz, 1H),3.47(m, 1H),3.05(s, 2H),1.67(dd,J=13.5, 6.4 Hz, 1H),1.52(d,J=8.3 Hz, 1H),1.46(d,J=4.3 Hz, 2H),1.36(m, 2H)。由圖5B可知,13C-NMR(151 MHz,DMSO)δ173.10、157.19、156.12、152.60、148.86、139.15、119.14、89.51、83.29、73.20、61.01、53.35、50.42、40.06、32.82、27.96、22.06。

    圖5 化合物II的1H-NMR(A)和13C-NMR(B)譜圖Fig. 5 1H-NMR (A) and 13C-NMR (B) spectra of compound II

    13C-NMR和無畸變極化轉移增強波譜數據表明化合物I、II均有17 個碳信號,包括5 個亞甲基、5 個次甲基、2 個亞乙烯基和5 個季碳,唯一的差別在于化合物I比化合物II多1 個羰基碳。比較腺苷、蟲草素、化合物I和化合物II的1H-NMR數據(表1),發(fā)現(xiàn)化合物I、II的部分核磁數據與腺苷、蟲草素均存在高度相似。由于蟲草素為3′-脫氧腺苷,是一種腺苷類似物,因此,推斷化合物I、II與腺苷也存在相同母核。為此,比較腺苷與化合物I、II的13C-NMR數據,發(fā)現(xiàn)化合物I、II的類腺苷骨架部分(C1~C10)與腺苷幾乎完全吻合,除了C6,這證明化合物I、II與腺苷確實存在相同母核。對比分析表2數據,化合物IδC6 50.56和化合物IIδC6 50.42相比于腺苷δC6 70.71均向高場位移,表明化合物I、II的類腺苷骨架部分在C6部位被電負性更小的取代基所取代[27]。

    除了類腺苷骨架部分,化合物I、II其余的1H-NMR和13C-NMR數據均由取代的側鏈產生,經分析比對發(fā)現(xiàn)側鏈部分的13C-NMR數據與已知化合物高瓜氨酸[28]基本相同,說明化合物I、II類腺苷骨架C6取代側鏈與其具有相同的碳骨架。再結合1H-1H COSY、NOESY以及HMBC遠程相關等二維核磁數據,確定相鄰碳上的氫在空間上的位置關系,最終確定化學結構式,發(fā)現(xiàn)兩者皆為氨基酸腺苷衍生物,氨基酸作為側鏈取代了腺苷骨架C6位上的羥基,如圖6所示。

    表1 化合物I、II與已知化合物的1H-NMR數據Table 1 1H-NMR data of compounds I, II and known compounds

    表2 化合物I、II與已知化合物的13C-NMR數據Table 2 13C-NMR data of compounds I, II and known compounds

    圖6 化合物I(A)和化合物II(B)的結構式Fig. 6 Structural formulae of compound I (A) and compound II (B)

    根據化學結構式,將化合物I和化合物II分別命名為2-amino-N-((2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-3-yl)-6-ureidohexanamide,以及2-amino-N-((2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-3-yl)-6-guanidinohexanamide。經SciFinder數據庫檢索比對,發(fā)現(xiàn)化合物II是一種全新的物質,尚鮮見有關文獻報道該結構,它在蛹蟲草生長過程中的合成途徑以及生物學功效仍有待進一步研究。目前,對于化合物I的研究也較少,僅Lichtenthaler等[29]在1979年從蛹蟲草中分離得到過該物質,囿于其在天然蛹蟲草中含量有限,研究人員以高瓜氨酸和3′-氨基-3′-脫氧腺苷為原料,建立了一種人工合成化合物I的途徑,并在生物學評價中證明該物質能夠在肽鏈延長階段干擾蛋白的合成,除此之外,尚鮮見其他文獻報道化合物I的生物學活性。

    2.4 各組分對HepG2肝癌細胞活力的影響

    圖7 不同質量濃度的蟲草素和2 種化合物對HepG2肝癌細胞的相對活力的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of cordycepin and the two compounds on the relative viability of HepG2 hepatoma cells

    蛹蟲草中的蟲草素作為一種潛在的抗腫瘤藥物被廣泛關注,美國國家癌癥研究所早在1997年就把蟲草素引入18 種抗癌新藥進行開發(fā)研究,大量實驗表明蟲草素能夠通過抑制腫瘤細胞DNA合成[30]、調控腫瘤細胞周期[31-33]、直接誘導腫瘤細胞凋亡[34]等方式發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此,本研究以蟲草素為對照,采用MTT法,比較化合物I、化合物II和蟲草素3 者對HepG2肝癌細胞作用的差異,其結果如圖7所示。

    由圖7可知,經過上述3 種藥物處理HepG2肝癌細胞后,HepG2肝癌細胞的相對活力隨藥物質量濃度的增大基本呈顯著降低的趨勢(P<0.05),且除化合物II以外,其他2 種藥物對HepG2肝癌細胞的增殖抑制作用均隨著作用時間的延長而明顯增強。當質量濃度同為10 μg/mL的蟲草素、化合物I和化合物II處理細胞24 h后,HepG2肝癌細胞的相對活力分別為(94.66±5.82)%、(95.34±8.77)%、(95.28±4.71)%,當質量濃度同為320 μg/mL的蟲草素、化合物I和化合物II處理細胞24 h后,HepG2肝癌細胞的相對活力分別為(46.37±1.77)%、(39.22±1.36)%、(64.71±8.72)%,后者較前者HepG2肝癌細胞的相對活力降低了48.29%、56.13%、30.57%。同理可得,當作用時間為48 h時,HepG2肝癌細胞的相對活力分別降低了43.07%、61.57%、40.14%;當作用時間為72 h時,分別降低了51.35%、66.32%、43.32%。

    表3 各組分對HepG2肝癌細胞的IC50Table 3 Half maximal inhibitory concentrations of cordycepin and the two compounds on HepG2 liver cancer cells

    經分析計算得到3 種藥物對HepG2肝癌細胞的IC50,如表3所示。結果表明,3 種藥物均能抑制HepG2肝癌細胞的增殖,且濃度越大,作用時間越長,抑制效果越明顯,抑制作用效果的順序依次為:化合物I>蟲草素>化合物II。長鏈脂肪酸衍生物被鑒定為一類新的具有抗MDA-MB-231乳腺癌活性的潛在藥物,Koolaji等[35]通過制備多種結構類似物,確定了其中的活性基團。因此,可通過藥物的構效關系分析本實驗結果:化合物I中C6位氨基酸衍生物的取代側鏈可能具有一定的生物活性,導致其對HepG2肝癌細胞的抑制作用強于蟲草素;而化合物I與化合物II具有完全相同的碳骨架,屬于結構類似物,兩者在C17位上分別由羰基和氨基取代,羰基與氨基在疏水性、親水性及空間位阻等方面的差異,可能影響藥物的滲透性以及藥物與靶點受體的結合能力,從而導致化合物I和化合物II對HepG2肝癌細胞抑制效果的不同。

    3 結 論

    C18和C18-HCE高效液相制備型色譜柱聯(lián)用,能夠有效改善核苷類化合物的保留和選擇性,蛹蟲草粗提液經過該方法分離制備后,得到腺苷、蟲草素、化合物I和化合物II 4 種組分,其純度和得率分別為90.49%、98.11%、96.34%、98.33%和0.053%、0.253%、0.368%、0.231%。經UPLC-QTOF MS、NMR鑒定,確定化合物I和化合物II均為氨基酸及其衍生物取代的核苷類衍生物,將兩者分別命名為2-amino-N-((2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-3-yl)-6-ureidohexanamid和2-amino-N-((2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-3-yl)-6-guanidinohexanamide,經過SciFinder數據庫檢索比對,確認化合物II是一種新化合物,尚鮮見有關文獻報道,其在蛹蟲草中的合成途徑以及生物學功效仍有待進一步研究。比較蟲草素、化合物I和化合物II的抗腫瘤活性,發(fā)現(xiàn)這3 種組分均能顯著抑制HepG2肝癌細胞的增殖,抗腫瘤效果順序依次為化合物I>蟲草素>化合物II。藥物抗腫瘤作用效果的差異可能與其結構相關,后續(xù)可針對藥物結構的差異進行更深入研究,以確定活性基團,這對于新藥合成,提高藥效具有一定的參考價值。除此之外,本實驗結果也為蛹蟲草中氨基酸核苷類衍生物的分離純化、結構鑒定、抗腫瘤作用的活性評價提供參考。

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