產(chǎn)低溫蛋白酶動(dòng)性球菌的篩選及其在低鹽魚(yú)露發(fā)酵中的應(yīng)用

周 晶，袁 麗，高瑞昌

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

魚(yú)露是一種很受歡迎的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，有獨(dú)特的風(fēng)味和口感。傳統(tǒng)魚(yú)露的生產(chǎn)通常以低值魚(yú)蝦為原料，混入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的食鹽，在魚(yú)體自身的酶和嗜鹽微生物的共同作用下，發(fā)酵數(shù)月制得[1]。鹽添加量、溫度、添加酶或產(chǎn)酶微生物等工藝是影響魚(yú)露風(fēng)味的主要因素，因此，為了縮短生產(chǎn)周期，保溫發(fā)酵、外加酶發(fā)酵和外加曲發(fā)酵等技術(shù)陸續(xù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)[2]，但魚(yú)露產(chǎn)品仍然存在高鹽的弊端。眾周所知，高鹽給人體健康帶來(lái)巨大的危害[3]，因此對(duì)低鹽魚(yú)露的開(kāi)發(fā)成為研究方向。低鹽發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生原料腐敗[4]，采用低溫發(fā)酵則會(huì)降低腐敗，但是低溫條件下微生物和酶的活性又受到抑制，同樣會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期。因此，在發(fā)酵過(guò)程中尋找加鹽量和發(fā)酵溫度的平衡，是實(shí)現(xiàn)低鹽魚(yú)露生產(chǎn)的重要問(wèn)題。理想的起始發(fā)酵劑應(yīng)該具備在低溫條件下能夠生長(zhǎng)并且產(chǎn)生的胞外蛋白酶具有較高酶活力的特性。

溫度是影響發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)生的重要參數(shù)之一。嗜冷菌通過(guò)產(chǎn)生冷適應(yīng)酶生存，這種酶具有應(yīng)對(duì)低溫引起化學(xué)反應(yīng)速率降低所需的特性[5]。低溫蛋白酶通常是指最適催化溫度在40 ℃及以下的一類蛋白水解酶[6]。在中低溫條件下，嗜冷酶有更高的活性，并且與嗜中溫酶相比，嗜冷酶能夠在較低的溫度下被滅活[7]。這些性能對(duì)于工業(yè)應(yīng)用非常有益。目前，應(yīng)用在食品工業(yè)中的蛋白酶大多屬于中高溫蛋白酶，溫度范圍是50～75 ℃[8-10]。在過(guò)去幾年，許多學(xué)者已經(jīng)分離出大量產(chǎn)冷適應(yīng)酶的微生物并進(jìn)一步研究，例如來(lái)自冰川土壤的地衣芽孢桿菌[11]、來(lái)自北極海冰的科威利亞菌[12]以及來(lái)自南極的梭狀芽孢桿菌屬[13]等。目前，冷適應(yīng)蛋白酶在冷水洗滌、生物降解以及低溫脫毛等工業(yè)過(guò)程中應(yīng)用廣泛，然而將冷適應(yīng)蛋白酶應(yīng)用于食品發(fā)酵中卻鮮見(jiàn)報(bào)道。利用產(chǎn)冷活性蛋白酶微生物作為發(fā)酵劑縮短魚(yú)露發(fā)酵周期，同時(shí)改善風(fēng)味的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，尤其是利用動(dòng)性球菌屬（Planococcus）。因此，本研究從傳統(tǒng)蝦醬中篩選并鑒定4 株動(dòng)性球菌，進(jìn)而探索其作為起始發(fā)酵劑應(yīng)用與低鹽魚(yú)露生產(chǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬為山東榮成市農(nóng)家自制；細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）由北京諾賽基因組研究中心有限公司提供；LB液體培養(yǎng)基、液體Gibbons培養(yǎng)基、牛奶平板、固體Gibbons培養(yǎng)基（干酪素、酵母提取物、胰蛋白胨、脫脂乳粉、檸檬酸三鈉、氯化鉀、七水硫酸鎂、氯化鈉、福林-酚、三氯乙酸、碳酸鈉） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型單人單面超凈臺(tái) 上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；UV1601紫外分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；Eppendorf AG 22331 Hamburg離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；HBA-1151聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 MJ Research公司；Alphalmager數(shù)字通用型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Alapha Innotech公司；恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；HZQ-2全溫振蕩器 江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選及鑒定

1.3.1.1 菌株富集和篩選

為了富集蛋白酶生產(chǎn)菌株，將1 g傳統(tǒng)蝦醬接種于99 mL的液體Gibbons培養(yǎng)基中。接種的三角燒瓶在25 ℃、150 r/min的旋轉(zhuǎn)搖瓶培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。將接種培養(yǎng)的一系列稀釋液（10-2～10-6）涂于含1%脫脂乳粉Gibbons瓊脂平板表面，15 ℃培養(yǎng)2 d。通過(guò)觀察菌落周圍形成一個(gè)清晰透明的區(qū)域，檢測(cè)到產(chǎn)蛋白酶菌株，然后，挑取該菌落進(jìn)行劃線純種培養(yǎng)并對(duì)菌種進(jìn)行保藏。

1.3.1.2 菌株鑒定

采用加熱的方法提取菌體基因組DNA并作為擴(kuò)增模板。使用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并進(jìn)行紫外照射。將細(xì)菌16S rRNA基因克隆到T載體并委托北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。使用EzBiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，并采用MEGA 6.0版構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)特性

活化菌株并按照2%的接種量接種于Gibbons液體培養(yǎng)基中，在不同溫度條件下測(cè)定菌懸液在660 nm波長(zhǎng)處的OD值，表示動(dòng)性球菌的生長(zhǎng)情況。溫度梯度設(shè)置為5、15、25、35 ℃和45 ℃，pH值梯度設(shè)置為4、6、7、8和10，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置為0%、5%、10%、15%和25%，培養(yǎng)48 h后測(cè)定OD值。

1.3.3 酶學(xué)特性

4 株菌的接種量均為1%，培養(yǎng)48 h后，取相同體積的培養(yǎng)液以10 000 r/min、4 ℃離心20 min，將離心得到的沉淀加入相同體積的蒸餾水重懸后用超聲進(jìn)行破碎，即為粗酶液，并將粗酶液保存于4 ℃。蛋白酶活力的測(cè)定采用福林-酚法[14]，先將10.0 g/L酪蛋白溶液和粗酶液分別放入40 ℃恒溫水浴中，預(yù)熱5 min。將1.0 mL酪蛋白溶液和1.0 mL粗酶液加入試管中并充分混勻，然后在40 ℃處理10 min。溫育結(jié)束時(shí)，取2.0 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）加入試管并混合。混合物4 ℃、10 000 r/min離心5 min。將1.0 mL上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中，加入5.0 mL碳酸鈉溶液和1.0 mL福林-酚試劑。充分混合后在40 ℃水浴中顯色反應(yīng)20 min。最后，在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度。在其他條件不變的情況下，將TCA滅活的酶液作為空白組。

為測(cè)定不同溫度條件對(duì)蛋白酶活力的影響，分別在20、30、40、50、60、70 ℃進(jìn)行酶促反應(yīng)10 min，測(cè)定蛋白酶活力。配制pH值為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的緩沖液，用緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白溶液作為底物，將酶液與一系列底物在40 ℃保溫，通過(guò)測(cè)定酶活力，得到酶反應(yīng)的最適pH值及pH值對(duì)酶活力的影響。在最佳pH值和溫度條件下，以0、3、6、9、12、15 g/100 mL為NaCl質(zhì)量濃度梯度，測(cè)定其對(duì)蛋白酶活力的影響。

1.3.4 低鹽魚(yú)露樣品的制備

從傳統(tǒng)發(fā)酵的蝦醬（山東威海，冬季采集）中分離得到了4 株動(dòng)性球菌，分別命名為P. maritimusXJ2、P. plakortidisXJ10、P. dechangensisXJ11和P. rifietoensisXJ12。這4 株動(dòng)性球菌保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），編號(hào)分別為CGMCC NO.17057、CGMCC NO.17058、CGMCC NO.17059和CGMCC NO.17060。以斑點(diǎn)叉尾鮰碎肉為原料進(jìn)行魚(yú)露發(fā)酵。先添加0.5%中性蛋白酶（Macklin，上海）對(duì)鮰魚(yú)碎肉進(jìn)行預(yù)水解（55 ℃，2 h），再加入1%木瓜蛋白酶（SCRS，上海）孵育3 h（45 ℃）。隨后將樣品冷卻至室溫，加入8%海鹽和3 mL/100 g的混合發(fā)酵劑（4 株動(dòng)性球菌的接種比例為1∶1∶1∶1），得到細(xì)胞密度約為106～107CFU/mL。在相同條件下，不添加發(fā)酵劑制備對(duì)照品。所有處理在21 ℃孵育15 d。添加混合發(fā)酵劑的魚(yú)露樣品記為A組，未添加混合發(fā)酵劑的樣品記為B組，原料碎魚(yú)肉記為C組。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）和總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）分析

AAN的測(cè)定采用比色法[15]。吸取2 mL魚(yú)露樣品于10 mL比色管中。加入4 mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4 mL顯色劑（甲醛和乙酰丙酮的混合溶液），用水稀釋至刻度，混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出，水浴冷卻至室溫后，移入比色皿內(nèi)，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度。TVB-N的測(cè)定參照GB 5009.44—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的微量擴(kuò)散法[16]。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

魚(yú)露中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過(guò)固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)鑒定[17]。將5 mL液體魚(yú)露樣品轉(zhuǎn)移到20 mL樣品瓶中并用硅膠墊密封。樣品在60 ℃水浴中加熱30 min，以獲得頂空平衡。使用石英纖維（DVD/CAR/PDMS，50/30 μm，Supelco，Bellefonte，Pa，U.S.A.）吸收頂部空間的揮發(fā)性化合物。將纖維引入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口，250 ℃解吸5 min。氣相色譜-質(zhì)譜分析采用初始溫度為40 ℃并保持4 min，然后以5 ℃/min速度增加到120 ℃并保持5 min，以15 ℃/min的速度增加到230 ℃并保持10 min。He作為載氣，流速為0.8 mL/min。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定3 種樣品中的揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選和鑒定

圖1 菌株在牛奶平板上產(chǎn)生的水解透明圈（A、B）及菌株的革蘭氏染色分析Fig. 1 Hydrolytic transparent circles produced by the isolates on agar plates with skim milk (A, B) and Gram-staining analysis

通過(guò)在添加脫脂乳粉瓊脂平板上觀察水解透明圈的方法，成功從傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中篩選并分離出4 株有較高蛋白酶活力的細(xì)菌。因?yàn)樵诩?xì)菌菌落周圍產(chǎn)生了清晰的水解圈（圖1），這4 株菌被鑒定為蛋白酶產(chǎn)生菌即XJ2、XJ10、XJ11和XJ12。在蛋白酶活力檢測(cè)中，與其他菌株相比，XJ11有最高的蛋白酶活力（（10.07±0.11）U/mL，P＜0.05，表1）。革蘭氏染色分析表明，4 株菌均為革蘭氏陽(yáng)性球菌，與張曉燕等[18]分離的沙雷氏菌有所不同，產(chǎn)低溫蛋白酶的沙雷氏菌為革蘭氏陰性菌。

表1 4 株菌的酶活力分析Table 1 Enzymatic activity analysis of four selected strains

使用序列分析軟件MEGA進(jìn)行核酸序列比對(duì)，進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。在16S rRNA基因分析的基礎(chǔ)上，利用BLAST搜索技術(shù)對(duì)4 株菌序列進(jìn)行系統(tǒng)描述和親緣關(guān)系鑒定。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，菌株XJ2、XJ10、XJ11和XJ12分別落在P. maritimusCP016538菌群、P. plakortidisCP016539菌群、P. dechangensisJQ762282菌群以及P. rifietoensisCP013659菌群中（圖2）。因此，將這4 株菌分別命名為P. maritimusXJ2、P. plakortidisXJ10、P. dechangensisXJ11和P. rifietoensisXJ12。

2.2 菌株的生長(zhǎng)特性

圖3 動(dòng)性球菌的生長(zhǎng)特性Fig. 3 Growth characteristics of Planococcus

在不同的培養(yǎng)溫度下探究液體培養(yǎng)基中動(dòng)性球菌的生長(zhǎng)特性。4 株動(dòng)性球菌均能在5～45 ℃的溫度下生長(zhǎng)，且在25 ℃時(shí)有最大生長(zhǎng)值（圖3a），這與沙雷氏菌A29-2有相同的溫度生長(zhǎng)特性[18]。在極端溫度下（5 ℃和45 ℃），菌株生長(zhǎng)非常緩慢。由圖3a可知，當(dāng)溫度為5～25 ℃時(shí)，細(xì)胞密度隨溫度的增加呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí)，細(xì)胞密度有下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)，菌株有最快的生長(zhǎng)速率，這也就表明動(dòng)性球菌能在低溫條件下較快生長(zhǎng)。環(huán)境中的pH值變化會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生重要的影響，主要是影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的解離與吸收。圖3b顯示，當(dāng)初始pH值為7～8時(shí)，測(cè)得的細(xì)胞密度最高，因此動(dòng)性球菌為中性偏堿性細(xì)菌。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于15%時(shí)菌株幾乎不生長(zhǎng)；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～15%時(shí)，細(xì)胞密度隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低（圖3c）。基于此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為動(dòng)性球菌不屬于嗜鹽菌，但具有一定的耐鹽性。在最優(yōu)的生長(zhǎng)條件下，測(cè)得動(dòng)性球菌的生長(zhǎng)曲線（圖3d）。16～48 h為動(dòng)性球菌的指數(shù)生長(zhǎng)期，即細(xì)胞密度快速增長(zhǎng)的階段，了解生長(zhǎng)曲線有助于準(zhǔn)確掌握接種時(shí)間，從而加快發(fā)酵速率。

2.3 粗蛋白酶酶學(xué)特性

圖4 溫度（a）、pH值（b）和NaCl質(zhì)量濃度（c）對(duì)蛋白酶酶活力的影響Fig. 4 Effect of temperature (a), pH (b) and NaCl concentration (c) on protease activity of the four strains

溫度、pH值和NaCl質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響較大。在優(yōu)化溫度的實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)性球菌所產(chǎn)的粗酶在10～60 ℃的溫度范圍內(nèi)有活性，在40 ℃時(shí)檢測(cè)到蛋白酶的最大活性（圖4a）。與南極嗜冷桿菌Ta41的蛋白酶S41（-2～4 ℃）[19]和嗜鹽古生菌Halogranum rubrum的耐鹽蛋白酶（50 ℃）[20]相比，動(dòng)性球菌的蛋白酶具有更好的冷適應(yīng)能力。在不同緩沖體系pH 3.0～11.0范圍內(nèi)，測(cè)定了pH值對(duì)蛋白酶活性的影響。結(jié)果（圖4b）表明，該蛋白酶在7.0～11.0的較寬pH值范圍內(nèi)具有活性。pH值為9.0時(shí)，動(dòng)性球菌XJ2、XJ10和XJ12所產(chǎn)的蛋白酶活性最高，說(shuō)明所產(chǎn)的酶是一種堿性蛋白酶，這與來(lái)自其他微生物的堿性蛋白酶也有相同的pH值范圍[21]。如圖4c所示，蛋白酶在NaCl質(zhì)量濃度為0～15 g/100 mL時(shí)有活性，在15 g/100 mL時(shí)活性最低。盡管蛋白酶在高鹽濃度下有所降低，但當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為1～9 g/100 mL時(shí)仍有較高的酶活力，因此該蛋白酶在一定程度上具有耐鹽性。

2.4 AAN和TVB-N含量

AAN是發(fā)酵產(chǎn)品最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一。在魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中，AAN的存在可歸因于蛋白酶的活性。本研究中發(fā)酵魚(yú)露中AAN含量在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，這結(jié)果與之前的報(bào)道相同[21-22]。在發(fā)酵的最后階段（15 d，圖5），A組中的AAN質(zhì)量濃度（1.33±0.08）g/100 mL明顯高于B組（（0.89±0.02）g/100mL，P＜0.01）。有報(bào)道指出，發(fā)酵2 a的傳統(tǒng)魚(yú)露的AAN質(zhì)量濃度可達(dá)到（1.10±0.03） g/100 mL[23]。在降低溫度和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同時(shí)仍然能夠保證魚(yú)露的質(zhì)量，這主要?dú)w功于采用動(dòng)性球菌作為起始發(fā)酵劑。與發(fā)酵劑Staphylococcussp. CMC5-3-1相比[24]，本實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間從180 d降低至15 d，加鹽量從25%降低至8%。根據(jù)以上的AAN結(jié)果，可以得知在發(fā)酵過(guò)程中添加動(dòng)性球菌發(fā)酵劑能夠有效增加魚(yú)露中AAN含量。TVB-N是反映魚(yú)露腐壞程度的主要指標(biāo)，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，2 組樣品的TVB-N值均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[25]。發(fā)酵15 d后，B組TVB-N質(zhì)量濃度達(dá)到（209.00±1.49）mg/100 mL，然而A組TVB-N質(zhì)量濃度（170.00±1.05）mg/100 mL明顯低于B組（P＜0.05）。結(jié)果表明，發(fā)酵劑（動(dòng)性球菌）可以抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，從而降低TVB-N含量。因此，動(dòng)性球菌可以作為一種新型的起始發(fā)酵劑，不僅能夠在低溫發(fā)酵條件下有較高的酶活力和發(fā)酵效率，還能夠提高AAN含量并有效降低TVB-N含量。

圖52 組魚(yú)露樣品在發(fā)酵過(guò)程中AAN和TVB-N含量的變化Fig. 5 Changes in amino acid nitrogen and total volatile base nitrogen contents in fish sauce samples inoculated and not inoculated with the mixed starter culture during fermentation

2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

如表2所示，其中7 類揮發(fā)性化合物通過(guò)固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜方法在低鹽魚(yú)露中被檢測(cè)出來(lái)，包括6 種醇類、4 種酸類、11 種醛類、6 種酮類、4 種酯類、6 種烷烴類和2 種吡嗪類，與傳統(tǒng)發(fā)酵法相比[23]（18 種），此法獲得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)更加豐富。發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品特殊的風(fēng)味主要來(lái)自于這幾類典型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，與前人的研究基本保持一致[24,26-27]。醛類是魚(yú)露中最豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[1]，因醛類閾值較低，因此對(duì)魚(yú)露整體風(fēng)味的形成有較大的貢獻(xiàn)。風(fēng)味物質(zhì)中醛類大多數(shù)來(lái)源于不飽和脂肪酸的氧化[28]。與B組相比，A組中己醛含量較高，其中己醛是亞油酸氧化的產(chǎn)物，具有青草香味[29]。A組中庚醛含量明顯低于B組和C組，庚醛則是被證實(shí)的一種魚(yú)腥味物質(zhì)。異戊醛和苯甲醛都屬于支鏈醛，來(lái)源于氨基酸的降解[30]，能夠賦予魚(yú)露杏仁和水果香味。A組中2-甲基丁醛和3-甲基丁醛含量均高于B組，這2 種物質(zhì)被認(rèn)為是魚(yú)露中最重要的揮發(fā)性醛并且對(duì)麥芽和堅(jiān)果氣味有貢獻(xiàn)[31]。因此，接種了發(fā)酵劑（動(dòng)性球菌）的魚(yú)露樣品產(chǎn)生了更加強(qiáng)烈的青草、麥芽和堅(jiān)果氣味以及降低了魚(yú)腥味。

醇類由于閾值較高，可能對(duì)魚(yú)露的風(fēng)味不會(huì)產(chǎn)生顯著的影響[32]。1-戊烯-3-醇對(duì)魚(yú)腥味的形成起重要的作用，A組中含量明顯低于B組和C組。酮類物質(zhì)的生成通常與微生物的活動(dòng)密切相關(guān)，主要釋放奶酪味、脂肪味和焦燃味[33]。含氮的雜環(huán)吡嗪主要通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中的Maillard反應(yīng)生成，主要產(chǎn)生烘焙和堅(jiān)果香氣。結(jié)果表明，所篩選的4 株動(dòng)性球菌對(duì)魚(yú)露特有風(fēng)味的形成有重要的影響并且有助于魚(yú)露整體香氣的產(chǎn)生。

表2 不同處理魚(yú)露發(fā)酵樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 2 Flavor description and quantitative analysis of volatile compounds of fish sauce samples inoculated and not inoculated with the mixed starter culture

續(xù)表2

3 結(jié) 論

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵的蝦醬中分離得到4 株產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株，經(jīng)菌種鑒定分別為P. maritimusXJ2、P. plakortidisXJ10、P. dechangensisXJ11和P. rifietoensisXJ12。4 株動(dòng)性球菌可在15～25 ℃進(jìn)行快速生長(zhǎng)代謝并且具有分泌低溫蛋白酶的能力。酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示：動(dòng)性球菌所產(chǎn)蛋白酶的最適溫度為40 ℃，最適pH值為9.0，并且當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度小于9 g/100 mL時(shí)有較高的酶活力。研究結(jié)果表明，利用所篩選的動(dòng)性球菌作為起始發(fā)酵劑在低鹽魚(yú)露的生產(chǎn)中具有一定的可行性和優(yōu)越性。動(dòng)性球菌在低溫發(fā)酵條件下具有較高的酶活力和發(fā)酵效率，促進(jìn)魚(yú)露典型特征風(fēng)味物質(zhì)的生成且降低魚(yú)腥味，能夠有效產(chǎn)生傳統(tǒng)魚(yú)露的典型風(fēng)味，降低傳統(tǒng)發(fā)酵的鹽濃度。本實(shí)驗(yàn)得到的4 株動(dòng)性球菌可作為一種有效的低鹽魚(yú)露發(fā)酵劑。