NaCl濃度對麥醇溶蛋白與槲皮素相互作用的影響

王啟明，唐瑜婉，李春翼，趙吉春，張宇昊，明 建,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

小麥在人類飲食中起著重要作用，小麥粉被廣泛用于以面粉為原料的食品中，如面包和面條[1]。盡管全世界的飲食模式不同，但小麥制品仍然是大多數(shù)人的主要食物來源。麥醇溶蛋白（gliadin，G），是小麥蛋白中主要的疏水性貯藏蛋白，具有兩親性和表面活性，在面包制作過程中具有維持氣室及在啤酒釀造中穩(wěn)定泡沫的潛力，主要用作面團流變性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的改良劑[2-3]。槲皮素（quercetin，Q），3,5,7,3′,4′-五羥基黃酮，是谷物（如小麥、蕎麥）、果蔬（如葡萄、洋蔥）中的主要類黃酮之一，具有抗菌、抗癌和抗過敏活性，被認(rèn)為是安全的食品添加劑，多羥基結(jié)構(gòu)能與食物基質(zhì)中的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，具有改善蛋白質(zhì)特性的潛力[4-6]。

近年來，食品工業(yè)中新型復(fù)合食品體系的需求量逐漸增加，蛋白質(zhì)、多酚作為生物體中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，兩者在食品加工及人體消化過程中的相互作用不可避免。研究證明，膳食多酚作為小麥粉添加劑，主要通過二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用等與面筋蛋白發(fā)生交聯(lián)，影響面團的流變學(xué)性質(zhì)及面制品的營養(yǎng)品質(zhì)[7-10]。在食品加工過程中，蕎麥粉和小麥粉?；旌鲜秤?，Q和G之間的相互作用，會引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的改變。王麗穎[11]采用反溶劑法，在pH 7.4條件下，運用熒光光譜技術(shù)結(jié)合濁度和粒徑分析，初步探討了G與Q二元體系的相互作用。研究結(jié)果證明Q對G有較強的熒光猝滅作用，猝滅方式為形成基態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。但研究未涉及到pH值、離子強度、溫度等典型化學(xué)加工條件。其中，pH值和離子強度影響蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)以及溶液中離子-偶極和離子-離子的相互作用，是影響食品組分間相互作用類型和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的重要因素[12]。通過實驗已經(jīng)證明不同pH值條件下Q通過共價鍵和非共價相互作用（氫鍵、靜電和疏水相互作用）與G結(jié)合，可以改善蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)以及Pickering乳液特性[13-14]。然而對于不同NaCl濃度下，Q與G的相互作用尚不清楚。

NaCl幾乎是所有烘焙產(chǎn)品和谷類零食不可或缺的一種成分，成為影響面團和谷類食品加工和質(zhì)量特性的關(guān)鍵因素[1]。Tang Yu等[15]指出，NaCl促成多肽在面筋中的解折疊和面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。因此，本實驗通過光譜技術(shù)初步研究不同NaCl濃度下G和Q的相互作用，便于更好地了解兩者的結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合力類型。此外，通過紅外光譜和拉曼光譜評估蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。旨在為了解不同NaCl濃度下G和Q的結(jié)合方式，以及拓寬兩者在小麥制品中的應(yīng)用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

G、Q 美國Sigma公司。

氯化鈉、乙醇、冰乙酸、溴化鉀（均為分析純）成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 金壇市科析儀器有限公司；XHFDY高速分散器 寧波新芝生物科技股份公司；UV-2450紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松原華興科技有限公司；Spectrum100傅里葉紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

在前期實驗基礎(chǔ)上，通過反溶劑法制備G及其復(fù)合物G/Q分散液[13]。在磁力攪拌下將1.0 g G和7.5 mg Q溶解在100 mL 70%（V/V）乙醇溶液中。在反溶劑過程中，水相-醇相體積比2.5∶1。將G溶液緩慢滴入1%（V/V）乙酸溶液中，邊滴邊均質(zhì)，然后在45 ℃水浴下旋蒸。在沒有Q的情況下相同條件制備蛋白溶液。調(diào)節(jié)溶液NaCl濃度，得到0、10、20、50、100、200 mmol/L的分散液，冷凍干燥，備用。

1.3.2 熒光光譜測定

參考王麗穎[11]的方法略作修改。

內(nèi)源熒光發(fā)射光譜：吸取1 mL不同NaCl濃度的混合溶液（混合前，G濃度為10 μmol/L，Q濃度梯度為0、3、5、10、20、30、60、100 μmol/L）。用F-2500熒光分光光度計分別在293、303、313 K下進行測定。激發(fā)波長λex=295 nm，掃描范圍為300～500 nm。參考Lakowicz[16]的方法校正內(nèi)濾光效應(yīng)。

結(jié)合類型、結(jié)合參數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)：采用Stern-Volme方程描述熒光猝滅：

式中：F0和F分別為不存在和存在猝滅劑（Q）時的熒光強度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s）），動態(tài)擴散的Kq最大值為2.0×1010L/（mol·s）；τ0為沒有熒光猝滅劑狀態(tài)下的平均熒光壽命，一般為10-8s；[Q]為Q的濃度/（μmol/L）；Ksv為Stern-Volme方程猝滅常數(shù)/（L/mol），通過F0/F對[Q]的曲線斜率計算獲得。

其結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)可用式（2）進行計算：

式中：Ka為結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為結(jié)合位點數(shù)。

通過Van’t Hoff方程計算出反應(yīng)的焓變（ΔH）、熵變（ΔS）、自由能變（ΔG），從而推測出蛋白與小分子物質(zhì)間的相互作用力。

由吉布斯自由能公式計算ΔG：

式中：R為理想氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；T為絕對溫度/K。

1.3.3 同步光譜測定

在250～500 nm波長范圍內(nèi)掃描樣品，293 K下進行同步熒光測量。設(shè)置波長差Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度保持恒定為5.0 nm，掃描速度為1 500 nm/min。

1.3.4 紫外光譜測定

參考王麗穎[11]的方法略作修改。以70%乙醇溶液為參比，依次移取3.0 mL樣品溶液于比色皿樣品池中。采用UV-2450分光光度計測定樣品在200～450 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

1.3.5 色氨酸距離測定

參考Lakowicz[16]的方法略作修改。以70%乙醇溶液為參比，分別用F-2500熒光分光光度計、UV-2450分光光度計測定G（5 μmol/L）的熒光光譜、Q（5 μmol/L）的紫外吸收光譜。

根據(jù)Forster’s能量轉(zhuǎn)移理論，供體（G）與受體（Q）之間的距離以及能量轉(zhuǎn)移效率用下式計算：

式中：F0和F分別為不存在和存在猝滅劑（Q）時的熒光強度；r為距離/nm；E為能量轉(zhuǎn)移效率/%；R0為能量轉(zhuǎn)移效率為50%時的Forster’s臨界距離/nm，可用下式計算：

式中：K2為過渡偶極子取向的空間因子，取值2/3；N為介質(zhì)的折射率，取值1.336；σ為供體的熒光量子產(chǎn)率，取值0.118；J為供體熒光光譜和受體吸收光譜的重疊積分，可用下式計算：

式中：F（λ）為供體在λ處的熒光強度；ε（λ）為波長在λ處時受體的摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

參考Liu Rui等[8]的方法略作修改。將干燥樣品（3.0 mg）與溴化鉀（50.0 mg）混合，壓成光滑圓片，在500～4 000 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)收集每個光譜，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32。

1.3.7 拉曼光譜測定

參考王麗穎[11]的方法略作修改。將干燥的樣品放在光滑的玻璃載玻片上，用激光拉曼顯微鏡在785 nm的激發(fā)波長下進行實驗。測試條件為：顯微鏡物鏡為20 倍，光斑尺寸為1 μm，狹縫寬度為50 μm，激光功率為15 mW，背景曝光時間為512 s，掃描范圍為500～4 000 cm-1，分辨率為1 cm-1，掃描次數(shù)為32。通過以1 003 cm-1的苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)進行歸一化處理。使用OMNIC 8.2（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,MA，USA）軟件進行光譜基線校正，平滑和原始數(shù)據(jù)歸一化處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗至少進行3 次重復(fù)，采用Sigma Plot 12.5和Origin 8.5軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度下Q對G熒光猝滅的影響

圖1 不同NaCl濃度下Q對G的熒光猝滅效應(yīng)Fig. 1 Fluorescence quenching effects of Q on G at different NaCl concentrations

蛋白質(zhì)固有的熒光團（色氨酸和酪氨酸）對其微環(huán)境的極性高度敏感。如圖1所示，G濃度為5 μmol/L，在未荷載Q時，不同NaCl濃度下蛋白在波長340 nm左右有最強熒光發(fā)射峰，而隨著Q的加入及濃度的增大，熒光強度降低且伴隨著明顯的藍移現(xiàn)象（0 mmol/L：343 nm→331 nm；10 mmol/L：343 nm→330 nm；20 mmol/L：344 nm→330 nm；50 mmol/L：344 nm→330 nm；100 mmol/L：345 nm→330 nm；200 mmol/L：344 nm→329 nm），表明Q與G之間存在相互作用，且Q以劑量依賴方式導(dǎo)致蛋白質(zhì)的熒光猝滅，與王晨等[10]報道的花青素對G的熒光猝滅和Joye等[17]報道的白藜蘆醇對G的熒光猝滅結(jié)果一致。當(dāng)Q濃度為50 μmol/L時，熒光猝滅率為96%～98%。蛋白質(zhì)處于折疊狀態(tài)時產(chǎn)生高熒光強度，色氨酸殘基通常位于蛋白質(zhì)的疏水環(huán)境中；而在展開狀態(tài)下，它們暴露于溶劑（親水環(huán)境）中，導(dǎo)致熒光強度降低[18]。藍移表明氨基酸附近的微環(huán)境極性減弱，疏水性增強，與Xia Wenyin等[19]的研究結(jié)果一致。隨著NaCl濃度的增大，藍移現(xiàn)象更明顯，表明NaCl在一定程度上能增強G與Q的相互作用。此外，在NaCl濃度條件下，蛋白發(fā)射帶的分離更加明顯，Hasni等[18]報道這與色氨酸殘基的更多暴露和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開有關(guān)。

表1 G/Q復(fù)合物在不同NaCl濃度和3 個溫度下的猝滅常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching constants and thermodynamic parameters of the formation of gliadin/quercetin (G/Q) complexes at different NaCl concentrations and three temperatures

圖2 不同溫度下Q猝滅G的Stern-Volmer圖Fig. 2 Stern-Volmer plot of Q quenching G at different temperatures

猝滅機理通常分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。溫度升高導(dǎo)致靜態(tài)猝滅常數(shù)降低或動態(tài)猝滅常數(shù)升高。如圖2所示，在較低的[Q]區(qū)域范圍，F(xiàn)0/F和[Q]之間存在線性相關(guān)性，在NaCl濃度為0 mmol/L時，Ksv（303 K）＞Ksv（313 K）＞Ksv（293 K）或Ksv（313 K）＞Ksv（303 K）＞Ksv（293 K），說明G與Q之間發(fā)生了動態(tài)猝滅現(xiàn)象。室溫（293 K）下，NaCl存在時的Ksv較大，表明在此溫度下離子的存在使Q對蛋白的熒光猝滅效應(yīng)有所增強，且順序為Ksv（50 mmol/L）＞Ksv（200 mmol/L）＞Ksv（20 mmol/L）＞Ksv（10 mmol/L）＞Ksv（100 mmol/L），離子可能也參與了相互作用過程。通過無熒光猝滅劑狀態(tài)下的平均熒光壽命τ0（一般為10-8s）和猝滅常數(shù)Ksv得到雙分子猝滅速率常數(shù)Kq（Ksv=10-8×Kq），如表1所示。Kq值（在2.16×1013～3.30×1013L/（mol·s）之間）高于最大動態(tài)猝滅速率，這表明在G和Q相互作用期間存在靜態(tài)猝滅，所以Q對G的猝滅方式為動、靜態(tài)結(jié)合。而在20 mmol/L NaCl濃度時，斜率隨溫度升高而降低，且不同溫度條件下Kq遠(yuǎn)大于最大動態(tài)猝滅速率2.0×1010L/（mol·s），說明此條件下的相互作用過程是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。王晨等[10]發(fā)現(xiàn)黑豆皮中的花青素對G的猝滅方式為動、靜態(tài)結(jié)合；Joye等[17]研究報道溫度在308 K上升到318 K的過程中，白藜蘆醇和G相互作用的猝滅常數(shù)呈現(xiàn)增大的趨勢，說明兩者的作用模式為動、靜態(tài)結(jié)合；而王麗穎[11]模擬生理pH值條件發(fā)現(xiàn)Q對G的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。以上結(jié)果表明，多酚種類及環(huán)境條件（pH值、NaCl濃度等）對G有不同的猝滅作用。

2.2 不同NaCl濃度下G/Q復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)分析

圖3 不同溫度下Q猝滅G的雙對數(shù)圖Fig. 3 Double logarithmic plot of Q quenching G at different temperatures

如圖3所示，lg[（F0-F）/F]和lg[Q]的擬合直線關(guān)系可提供結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n的信息，其值列于表1。Ka值均較大，數(shù)值為106～107量級，屬于強相互作用范疇[20]，Q與G的相互作用強于花青素[10]和白藜蘆醇[17]。各條件下n＞1，表明G與Q之間至少有一個結(jié)合位點。與G與其他多酚相互作用的研究結(jié)果一致[10-11,17]。

2.3 不同NaCl濃度下G/Q復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合力類型分析

為了研究G與Q之間的主要結(jié)合力，獲得了熱力學(xué)參數(shù)（ΔG、ΔH和ΔS）的數(shù)值。根據(jù)Ross等[21]的結(jié)果，如果ΔH＜0和ΔS＜0，則主要力是范德華力和氫鍵；如果ΔH＞0和ΔS＞0，則為疏水作用；如果ΔH＜0且ΔS＞0，則為靜電相互作用。由表1可得，50 mmol/L NaCl濃度下，G與Q之間主要為疏水作用力，ΔH＞0表明G與Q的相互作用為吸熱反應(yīng)，升溫有利于反應(yīng)的進行，這與結(jié)合常數(shù)Ka值隨溫度升高而趨于升高相吻合；而其他NaCl濃度下，G與Q之間主要為氫鍵相互作用，20 mmol/L NaCl濃度下存在靜電作用。王麗穎[11]的研究發(fā)現(xiàn)G與Q結(jié)合的主要驅(qū)動力是氫鍵和范德華力，說明NaCl濃度影響著蛋白-多酚的主要結(jié)合力類型。而所有NaCl濃度下ΔG＜0，表明G與Q的結(jié)合可以自發(fā)進行。

2.4 Q與G相互作用的同步光譜分析

圖4 不同NaCl濃度下Q對G同步熒光光譜的影響Fig. 4 Effect of Q on the synchronous fluorescence spectrum of G at different NaCl concentrations

同步熒光光譜技術(shù)可以研究配體對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。根據(jù)最大發(fā)射波長和熒光強度的變化，它可以提供熒光團官能團附近微環(huán)境的極性變化的信息[13]。采用同步光譜法記錄不同NaCl濃度下蛋白質(zhì)色氨酸殘基和酪氨酸殘基在Q作用下的特征光譜。激發(fā)和發(fā)射波長之間的差值（Δλ）設(shè)置為15 nm或60 nm，則顯示酪氨酸或色氨酸殘基周圍的環(huán)境變化。如圖4所示，不同NaCl濃度下，隨著Q濃度的增大，蛋白的酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強度均有猝滅現(xiàn)象且最大吸收波長均有不同程度的紅移現(xiàn)象，與王晨等[10]的研究結(jié)果一致。該觀察結(jié)果表明，Q使熒光團附近區(qū)域極性增大。Q與G之間的相互作用，使得蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，熒光強度降低，氨基酸殘基間的能量傳遞也降低。酪氨酸殘基紅移1～2 nm（圖4A）；色氨酸殘基紅移2～4 nm（圖4B）。在所測試的NaCl濃度下，色氨酸殘基強于酪氨酸殘基，這表明色氨酸殘基對蛋白固有熒光的猝滅貢獻更大[22]。黃淵等[23]指出表沒食子兒茶素沒食子酸酯與肌球蛋白相互作用過程中，色氨酸比酪氨酸的熒光貢獻率更大，這與激發(fā)波長的設(shè)置及兩種氨基酸的相對含量有關(guān)。不同NaCl濃度下，最大發(fā)射波長和熒光強度明顯不同，表明熒光團附近微環(huán)境的極性變化受離子強度的影響。

2.5 Q與G相互作用的紫外光譜分析

利用蛋白質(zhì)的紫外-可見吸收光譜初步探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化，會引起蛋白吸收波長的改變[24]。280 nm波長附近的吸收峰屬于蛋白氨基酸（色氨酸和酪氨酸殘基）。如圖5所示，在Q和NaCl添加的情況下，蛋白質(zhì)的吸收峰顯示出增色現(xiàn)象，最大吸收值出現(xiàn)約20 nm的藍移。吸光度的這種變化表明，蛋白質(zhì)發(fā)色團周圍的微環(huán)境發(fā)生了變化，蛋白分子內(nèi)部色氨酸和酪氨酸殘基中的芳香雜環(huán)疏水基團暴露。在365 nm波長左右也出現(xiàn)了一個峰，這表明在復(fù)合物形成過程中Q被氧化，可能發(fā)生了蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[25]。最大吸收峰的變化也進一步證明復(fù)合物的形成。與0 mmol/L NaCl濃度的蛋白相比，200 mmol/L NaCl濃度下G的紫外光譜在275 nm波長附近的吸收峰略微降低，這可能是蛋白的自聚集反應(yīng)所致。荷載Q后明顯改變了蛋白的紫外光譜，且隨著NaCl濃度的增加，在253 nm波長附近的紫外特征吸收峰逐漸增強。以上結(jié)果表明Q與G的復(fù)合改變了蛋白的分子結(jié)構(gòu)，且一定NaCl濃度使得色氨酸和酪氨酸殘基附近疏水性增強，從而改變蛋白質(zhì)構(gòu)象。劉勤勤等[24]報道加入茶多酚后，大豆分離蛋白的色氨酸和酪氨酸微環(huán)境的變化，表明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。王斌[26]指出蛋白構(gòu)象的改變更有利于分子中色氨酸和酪氨酸殘基芳香雜環(huán)的π—π*躍遷。

圖5 紫外-可見吸收光譜的變化Fig. 5 Changes in UV-visible absorption spectra

2.6 Q與G相互作用的能量轉(zhuǎn)移分析

由于分子之間的偶極-偶極相互作用，能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象發(fā)生在激發(fā)態(tài)的供體和受體之間。這種現(xiàn)象的發(fā)生程度取決于供體發(fā)射和受體吸收光譜之間的重疊程度，供體量子產(chǎn)率，供體和受體轉(zhuǎn)變偶極子的取向，以及供體和受體分子之間的距離。由于距離特異性，能量轉(zhuǎn)移分析可用于確定供體和受體分子之間的距離[16]。圖6為Q UV-Vis吸收光譜和G熒光發(fā)射光譜的重疊光譜，根據(jù)公式（5）～（7）可計算J、E、R0和r的值，見表2。不同NaCl濃度下，r值在3.12～3.69 nm范圍內(nèi)，均小于8 nm，這表明分子之間具備能量轉(zhuǎn)移的條件，且非輻射能量轉(zhuǎn)移也是引起熒光猝滅的原因之一[16]。不同NaCl濃度下，J、E、R0和r的值明顯不同，表明能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)生程度受離子強度的影響。

圖6 G的熒光光譜和Q的吸收光譜merge圖Fig. 6 Merge between the fluorescence spectrum of wheat gliadin and absorption spectrum of quercetin

表2 不同NaCl濃度下G和Q之間的分子結(jié)合距離Table 2 Intermolecular binding distances between G and Q at different NaCl concentrations

2.7 不同NaCl濃度下Q對G結(jié)構(gòu)影響的傅里葉變換紅外光譜分析

通過分析蛋白質(zhì)紅外光譜譜帶，可獲取蛋白某些官能團的變化信息，確定是否有新化合物或官能團的形成，以及分子間可能存在的作用力類型。如圖7所示，G在3 000～3 500、2 960、1 650～1 660、1 540～1 560、1 100 cm-1附近顯示出主要特征峰。3 000～3 500 cm-1為O—H伸縮振動；2 960 cm-1為CH2伸縮振動；1 650～1 660 cm-1為酰胺I帶，代表C＝O拉伸振動；1 540～1 560 cm-1為酰胺II帶，代表C—N拉伸與N—H彎曲振動；1 100 cm-1為C—O基團的拉伸振動[13]。

圖7 不同NaCl濃度下G及其與Q復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 7 FIIR spectra of G and their complexes with Q at different NaCl concentrations

NaCl濃度為0 mmol/L時，蛋白在3 000～3 500 cm-1范圍的特征峰所對應(yīng)波數(shù)為3 427 cm-1，隨著NaCl濃度的增大，特征峰發(fā)生藍移（在NaCl濃度為200 mmol/L時，波數(shù)為3 435 cm-1），但荷載Q后導(dǎo)致特征峰發(fā)生紅移，表明蛋白在形成氫鍵的過程中受到NaCl濃度和Q的影響[27]。在荷載Q后，蛋白的酰胺II帶從1 548 cm-1處，移至1 553 cm-1（0 mmol/L）、1 547 cm-1（10 mmol/L）、1 546 cm-1（50 mmol/L）、1 555 cm-1（200 mmol/L），證明Q與C—N和N—H基團發(fā)生了相互作用。同樣，不同NaCl濃度蛋白在2 960 cm-1附近的吸收峰也發(fā)生了藍移或紅移，表明一定NaCl濃度下特殊的離子作用穩(wěn)固偶極子而增強了疏水作用[28]。蛋白的紅外光譜圖在1 000～4 000 cm-1范圍的波數(shù)所對應(yīng)特征峰發(fā)生不同程度的紅移或藍移，表明不同NaCl濃度下蛋白質(zhì)內(nèi)部分子構(gòu)象不同，酰胺帶紅外吸收峰的變化表明Q引起G的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[8,25]。在特定NaCl濃度下，G與Q可能有特定的作用方式，氫鍵或疏水相互作用在復(fù)合物的形成中起重要作用。

2.8 不同NaCl濃度下Q對G結(jié)構(gòu)影響的拉曼光譜分析

拉曼光譜可提供不同NaCl濃度下G及其復(fù)合物的構(gòu)象變化和氨基酸側(cè)鏈微環(huán)境變化。拉曼光譜掃描圖譜中，特征峰的譜線強度與蛋白質(zhì)中化學(xué)鍵或基團數(shù)目成正比[29]。通過樣品譜線強度變化來判斷化學(xué)鍵或基團是否變化。樣品在600～3 200 cm-1范圍內(nèi)的拉曼光譜掃描圖譜如圖8A所示，譜帶歸一化強度如圖8B、C所示。

選用對蛋白質(zhì)構(gòu)象或微環(huán)境變化不敏感的苯丙氨酸（1 003 cm-1）的強度作為內(nèi)標(biāo)歸一化譜帶振動強度[30]。圖8A中，隨著Q和NaCl的添加，酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）、脂肪酸氨基酸C—H振動（1 448 cm-1和2 934 cm-1）、酰胺III帶（1 230～1 340 cm-1）的特征峰峰型和強度發(fā)生改變，表明不同NaCl濃度及Q的引入影響蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化。圖8B中酰胺I帶和酰胺III帶強度的變化可以表征蛋白二級結(jié)構(gòu)變化，振動位置主要在1 656 cm-1和1 248 cm-1處。對于酰胺帶，不同的譜帶范圍代表不同的蛋白質(zhì)構(gòu)象（α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲）。Wang Hingwan等[31]指出，蛋白質(zhì)在1 667～1 673 cm-1附近的酰胺I帶和1 230～1 240 cm-1附近的酰胺III帶主要是β-折疊結(jié)構(gòu)，而具有高比例α-螺旋結(jié)構(gòu)的酰胺帶處于1 650～1 660 cm-1和1 260～1 300 cm-1附近，1 665 cm-1的酰胺I帶和1 245 cm-1的酰胺III帶附近含有大量無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。因此，圖8中蛋白酰胺帶的位置及譜帶強度表明G含有較多的α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，與仇超穎[32]的研究結(jié)果一致。圖8C中C—H鍵的彎曲和拉伸振動主要在1 448 cm-1和2 934 cm-1處，Sun Weizheng等[33]指出C—H鍵振動強度升高，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去折疊及脂肪族氨基酸側(cè)鏈的暴露。Herrero等[30]將C—H鍵振動強度的降低歸因于脂肪族氨基酸殘基周圍的疏水相互作用。目前，關(guān)于1 450 cm-1附近的歸一化強度增強或降低的變化存在爭議，但普遍認(rèn)為C—H振動的變化可能引起蛋白質(zhì)脂肪族氨基酸殘基微環(huán)境和三級結(jié)構(gòu)的變化[34]。此外，不同NaCl濃度下蛋白及其復(fù)合物的色氨酸（760 cm-1）、酪氨酸（850 cm-1和830 cm-1）對應(yīng)的特征峰強度和峰型發(fā)生變化，表明色氨酸、酪氨酸殘基微環(huán)境也發(fā)生了變化。以上結(jié)果表明，不同NaCl濃度下，蛋白及其復(fù)合物的二級、三級結(jié)構(gòu)及氨基酸側(cè)鏈微環(huán)境發(fā)生了變化，但對于具體的結(jié)構(gòu)含量變化仍需進行定量分析。

圖8 不同NaCl濃度下G及其與Q復(fù)合物的拉曼光譜及歸一化基團強度Fig. 8 Raman spectra and normalized group intensity of G and their complexes with Q at different NaCl concentrations

3 結(jié) 論

本實驗在不同NaCl濃度下，利用光譜學(xué)技術(shù)探究了G與Q之間的相互作用。研究證明，Q能對G產(chǎn)生靜態(tài)或動、靜態(tài)結(jié)合的熒光猝滅作用。在不同NaCl濃度下G與Q通過靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用相結(jié)合，在50 mmol/L NaCl濃度下以疏水相互作用為主導(dǎo)。Q和NaCl的加入改變了蛋白質(zhì)色氨酸、酪氨酸殘基的微環(huán)境。酰胺帶吸收峰的變化表明Q引起G結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本研究為了解不同NaCl濃度下G和Q的結(jié)合方式以及蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化提供了參考。在食品工業(yè)中，利用相互作用，可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的回收，大大提高小麥蛋白資源的利用率；但不同NaCl濃度下，蛋白及其復(fù)合物理化性質(zhì)的變化（如質(zhì)構(gòu)特性、流變特性等）仍需進一步探究，以便更好地拓寬兩者在小麥制品中的應(yīng)用范圍。