感染性疾病mRNA疫苗的研究進(jìn)展*

李 珍， 鄭 芳， 程范軍△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 1血液科 2兒科，武漢 430022

近年來，核酸疫苗的研發(fā)已經(jīng)成為疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。核酸疫苗分為DNA疫苗和RNA疫苗兩種。與滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、肽類疫苗以及DNA疫苗相比，mRNA疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)。第一，安全：mRNA不存在感染或插入突變的潛在風(fēng)險，可通過正常細(xì)胞途徑被降解，其體內(nèi)半衰期可通過使用各種修飾和傳遞方法來調(diào)節(jié)，各種修飾和傳遞方法還可增加mRNA疫苗的穩(wěn)定性而降低其負(fù)性免疫應(yīng)答(如抑制抗原的表達(dá))[1-2]。第二，高效：各種修飾提高了mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，通過載體分子實(shí)現(xiàn)高效的體內(nèi)傳遞。mRNA避免了預(yù)先存在或疫苗誘導(dǎo)的抗載體免疫，因此可以反復(fù)使用。第三，高產(chǎn)能：mRNA疫苗具有快速、廉價和可大量生產(chǎn)的潛力，是應(yīng)對突發(fā)急性傳染病的重要策略之一[1，3]。隨著mRNA合成技術(shù)、分子修飾技術(shù)、遞送技術(shù)的迅速發(fā)展，mRNA疫苗在感染性疾病、過敏性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤疾病的防治中取得了巨大進(jìn)展[4]。本綜述將概述mRNA疫苗在感染性疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展及其面臨的挑戰(zhàn)。

1 mRNA疫苗概述

mRNA疫苗是將在體外合成的編碼特定抗原的mRNA序列遞送至體內(nèi)并表達(dá)相應(yīng)的抗原蛋白，通過誘導(dǎo)針對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的[1]。mRNA疫苗目前主要有兩種形式：非復(fù)制型mRNA疫苗(non-replicating mRNA，NRM)和自我擴(kuò)增型mRNA疫苗(self-amplifying mRNA，SAM)，它們都是由正鏈RNA病毒衍生而來的。這兩種形式的疫苗均包括5個元件：5′帽子結(jié)構(gòu)(Cap)、5′和3′非編碼區(qū)(UTR)、開放閱讀框(ORF)和3′Poly(A)尾[5]。NRM由編碼抗原和兩側(cè)的5′UTR和3′UTR構(gòu)成；SAM不僅能編碼抗原，還有類似病毒復(fù)制過程的序列，使其可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制以提高抗原蛋白表達(dá)量。NRM疫苗具有結(jié)構(gòu)簡單、RNA序列較短及無額外的編碼蛋白，不會引起無關(guān)免疫反應(yīng)的優(yōu)勢。與NRM疫苗相比，SAM疫苗接種會產(chǎn)生更高的抗原表達(dá)水平，且mRNA疫苗的有效接種劑量要低得多[6-7]。mRNA疫苗是通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)生產(chǎn)的，以DNA為模板(如線性化質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物)，在T7，T3或Sp6噬菌體RNA聚合酶存在的條件下體外轉(zhuǎn)錄合成，最后加上5′Cap和3′Poly(A)尾，這一過程無需依賴細(xì)胞擴(kuò)增，因此可快速大量生產(chǎn)[8]。

2 mRNA疫苗的制備

mRNA疫苗的制備主要涉及抗原的選擇、mRNA疫苗的優(yōu)化、遞送系統(tǒng)的研發(fā)、疫苗免疫效果評價及其有效性和安全性評估等方面。mRNA可發(fā)揮疫苗的作用在20世紀(jì)90年代就已被發(fā)現(xiàn)，但隨后的發(fā)展并不順利，因?yàn)镽NA必須避開RNase介導(dǎo)的降解和清除到達(dá)靶組織；當(dāng)RNA遇到靶細(xì)胞時，必須通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而啟動宿主翻譯機(jī)制和非結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯。因此如何提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，以及研發(fā)優(yōu)良的遞送載體是目前mRNA疫苗制備面臨的主要問題[9]。

目前已有許多mRNA優(yōu)化技術(shù)用來提高翻譯效率和穩(wěn)定性，比如優(yōu)化5′UTR區(qū)和3′UTR區(qū)的調(diào)控元件來穩(wěn)定mRNA并增加蛋白質(zhì)翻譯；使用修飾的核苷酸來減少先天免疫激活并提高翻譯效率；合成帽類似物和帽酶以及通過與真核翻譯起始因子4E(EIF4E)結(jié)合來增加蛋白質(zhì)翻譯從而穩(wěn)定mRNA；通過分離和(或)凈化技術(shù)來純化mRNA，從而減少雜質(zhì)的產(chǎn)生以免引起非特異性免疫；對序列和(或)密碼子的優(yōu)化來增加翻譯等等[1，10]。雖然以上方式能積極調(diào)控蛋白表達(dá)，但這些形式的優(yōu)化可能會影響mRNA的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其與人體自然轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)構(gòu)不一致，從而在蛋白質(zhì)翻譯和激活免疫反應(yīng)的過程中存在差異[1]。

優(yōu)良的遞送載體對mRNA疫苗的有效性同樣重要。理想情況下，遞送載體應(yīng)該保護(hù)RNA免受核糖核酸酶的潛在消化，并提供有效的靶細(xì)胞攝取，容易將RNA從載體上解離出來，并從內(nèi)體中逃逸，并且載體應(yīng)做到缺乏毒性和免疫刺激[4]。目前為止已有2種基本的方法來遞送mRNA：第一，將mRNA加載到體外的樹突狀細(xì)胞(DCs)中再注入患者體內(nèi)；第二，直接注射有或沒有載體的mRNA[1，11]。根據(jù)遞送載體的性質(zhì)不同又分為病毒遞送的mRNA疫苗和非病毒遞送的mRNA疫苗兩大類，其中非病毒遞送包括裸mRNA直接注射、電穿孔、基因槍、魚精蛋白、陽離子脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米粒子(LNP)、陽離子納米乳液(CNE)、聚合物納米粒等，其中LNP遞送載體是近年來研究的熱點(diǎn)[12]。

3 mRNA疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的機(jī)制

接種mRNA疫苗后，mRNA首先被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞的mRNA目前主要由2類模式識別受體(PRRs)來識別，一類是Toll樣受體(TLRs)，包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，主要定位于樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等細(xì)胞的內(nèi)體中；另一類是定位于細(xì)胞質(zhì)中的其他PRRs家族，包括RIG-I樣受體家族(RLRs，包括RIG-I、MDA5和LGP2)、核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRs)、寡腺苷酸合成酶受體(OAS)和RNA依賴性蛋白激酶(PKR)[13]。這些不同途徑的級聯(lián)信號通路的激活可導(dǎo)致Ⅰ型干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-12、趨化因子(如CXCLs和CCLs)等的分泌，并在注射部位聚集，為誘導(dǎo)免疫反應(yīng)創(chuàng)造了一個促炎的微環(huán)境[14]。如趨化因子可招募固有免疫細(xì)胞如DCs和巨噬細(xì)胞至接種部位從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；促炎細(xì)胞因子如TNF-α不僅誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而且有利于DCs向引流淋巴結(jié)(dLNs)的遷移從而誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫，已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在接種部位和引流淋巴結(jié)中均能檢測到mRNA和編碼的抗原[15]。mRNA可從內(nèi)體逃逸至細(xì)胞質(zhì)中并利用宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制翻譯成蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)產(chǎn)物可被降解為抗原肽并通過MHC Ⅰ類分子途徑提呈給CD8+T細(xì)胞從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；也可被分泌至胞外經(jīng)抗原提呈細(xì)胞(APCs)攝取，通過MHC Ⅱ類分子途徑將抗原提呈給CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；還可通過抗原交叉提呈途徑參與免疫應(yīng)答[16]。

另一方面，在mRNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中，Ⅰ 型IFN能促進(jìn)抗原致敏的CD8+T細(xì)胞向CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞分化也能誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭；Ⅰ 型IFN抑制或促進(jìn)CD8+T細(xì)胞毒性效應(yīng)可能與其持續(xù)分泌的時間、強(qiáng)度及受體有關(guān)[4，17]。此外，Ⅰ 型IFN可以誘導(dǎo)多種IFN刺激基因而抑制mRNA的翻譯和促進(jìn)mRNA的降解，從而抑制抗原的表達(dá)，對免疫應(yīng)答產(chǎn)生消極作用[18]。因此，mRNA疫苗在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答是非常復(fù)雜的過程。此外，一些研究表明mRNA純度和遞送載體會影響mRNA疫苗刺激的免疫反應(yīng)，如Karikó等[19]研究表明用偽核苷修飾的mRNA和用高效液相色譜(HPLC)純化的mRNA可以降低免疫激活，增加抗原的穩(wěn)定性和表達(dá)。Pardi等[20]研究表明LNP封裝的經(jīng)過修飾的mRNA疫苗具有佐劑效應(yīng)且能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

4 mRNA疫苗在感染性疾病中的應(yīng)用進(jìn)展

mRNA疫苗在病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原菌感染所致的疾病中均有應(yīng)用，但主要應(yīng)用于病毒感染性疾病且以RNA病毒感染為多見，感染性疾病mRNA疫苗的臨床研究如表1所示。

表1 感染性疾病mRNA疫苗的臨床研究*Table 1 Clinical research of mRNA vaccine for infectious diseases*

4.1 mRNA疫苗在病毒感染性疾病中的應(yīng)用

4.1.1 RNA病毒感染性疾病 mRNA疫苗在RNA病毒感染性疾病中的研究聚焦于具有傳染性強(qiáng)、危害性大的RNA病毒，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、寨卡病毒(ZIKA)、人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、埃博拉病毒(EBOV)和狂犬病毒等。

截止2020年11月22日，被列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件的SARS-CoV-2感染確診病例已超過5780萬例，死亡病例增至130多萬例[35]。目前為止，已有多種針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段(表1)。其中mRNA-1273疫苗由以LNP為載體的編碼S蛋白的mRNA組成，該疫苗已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，在所有受試者中均誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答，且在100 μg劑量組中均誘導(dǎo)了持續(xù)高水平的中和抗體滴度，未報告疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良事件(SAEs)[21]。目前該疫苗已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，旨在評估其安全性和能否有效預(yù)防新冠病毒感染，以及能夠?yàn)槿梭w提供多長時間保護(hù)[36]。BioNTech公司與復(fù)星醫(yī)藥及輝瑞聯(lián)合研發(fā)的mRNA疫苗BNT162正在進(jìn)行Ⅱ/Ⅲ期試驗(yàn)以評估其安全性和有效性[22-23]。目前國內(nèi)首個新冠mRNA候選疫苗(ARCoV)已正式獲批啟動臨床試驗(yàn)，此外全球還有許多SARS-CoV-2 mRNA疫苗的研究，但大多處于臨床前期試驗(yàn)階段[24，37]。

甲型流感對人類致病性高，曾多次引起世界性大流行。Magini等[38]首次發(fā)現(xiàn)以LNP為載體的編碼基質(zhì)蛋白1(M1)和內(nèi)部核蛋白(NP)的SAM疫苗聯(lián)合單價滅活流感疫苗(MIIV)可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，這種疫苗不僅靶向同源流感病毒還可在其他亞型流感病毒感染中產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。有動物實(shí)驗(yàn)表明，即使在單次應(yīng)用編碼各種流感病毒HA、NP和NA的mRNA疫苗(包含未經(jīng)修飾、純化的、抗原編碼的和魚精蛋白復(fù)合物的mRNA)也會誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)[39]。目前已有以LNP為載體的經(jīng)化學(xué)修飾的編碼H10N8或H7N9血凝素的mRNA疫苗進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，研究結(jié)果顯示疫苗能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)而發(fā)揮明顯的預(yù)防保護(hù)作用，且未報告SAEs[27]。

RSV感染是5歲以內(nèi)兒童病毒性肺炎的主要病原體，也是因嚴(yán)重下呼吸道感染住院的主要原因。Geall等[40]發(fā)現(xiàn)給小鼠和棉鼠肌注極低劑量的以LNP為載體的編碼F蛋白的SAM疫苗，可誘導(dǎo)產(chǎn)生極高滴度的IgG抗體，且IgG2a抗體的滴度要高于IgG1抗體滴度；同時誘導(dǎo)明顯的CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。Brito等[41]研發(fā)了一種利用CNE為遞送載體編碼RSV F蛋白的mRNA疫苗，該疫苗免疫接種于小鼠后可在體內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的抗原特異性IgG抗體和RSV中和性抗體。

ZIKA感染主要在全球熱帶及亞熱帶地區(qū)流行，可通過母嬰傳播致使胎兒生長發(fā)育異常。ZIKA的E蛋白由3個外結(jié)構(gòu)域(DⅠ、DⅡ和DⅢ)組成，是中和抗體的主要靶點(diǎn)，ZIKA與登革熱病毒(DENV)的E蛋白具有54%至59%的氨基酸同源性，ZIKA mRNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有可能增加患者對嚴(yán)重DENV感染的敏感風(fēng)險。為了降低這種交叉反應(yīng)，對編碼寨卡病毒包膜蛋白prM-E的mRNA進(jìn)行修飾，破壞E蛋白中保守的融合環(huán)表位即免疫顯性交叉反應(yīng)表位，最后再用LNP遞送。這種經(jīng)修飾的mRNA疫苗既誘導(dǎo)了小鼠對ZIKV的保護(hù)性抗體反應(yīng)又減少了交叉反應(yīng)抗體的產(chǎn)生[42]。目前已有針對ZIKV的mRNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，如mRNA-1325，此疫苗是由LNP遞送的編碼prM-E蛋白的并經(jīng)過核酸修飾的mRNA疫苗，但尚未公布臨床試驗(yàn)結(jié)果[29]。

埃博拉病毒病是一種烈性傳染病，可引起嚴(yán)重的出血熱，死亡率極高。Meyer等[43]研發(fā)了2種編碼EBOV糖蛋白的mRNA疫苗：疫苗A(編碼全長EBOV糖蛋白的疫苗)和疫苗B(將糖蛋白的真實(shí)信號肽與來自人類Igκ的信號肽替換)。2種疫苗均以LNP為載體肌注至豚鼠體內(nèi)，結(jié)果表明2種疫苗接種后均能產(chǎn)生EBOV糖蛋白特異性的IgG抗體以及EBOV中和抗體，但疫苗B產(chǎn)生的抗體滴度均高于疫苗A；研究還表明對已感染EBOV的豚鼠進(jìn)行疫苗接種后，豚鼠的存活率為100%[43]。

艾滋病是危害性極大的傳染病，HIV能攻擊人體的免疫系統(tǒng)從而出現(xiàn)各種嚴(yán)重并發(fā)癥。Ganghi等[32]將編碼HIV-1的Gag或Nef基因且含有溶酶體靶向序列的mRNA轉(zhuǎn)染到DCs中后接種于人體，可在體內(nèi)觀察到抗原特異性免疫反應(yīng)，但免疫反應(yīng)與安慰劑組沒有差異。Jacobson等[30]研發(fā)的AGS-004疫苗是將來源于患者自身HIV-1的Gag、Nef、Rev和Vpr抗原編碼至mRNA中，再轉(zhuǎn)染到患者的DCs中，該疫苗在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療期間誘導(dǎo)了特異性免疫反應(yīng)，但與安慰劑相比，使用AGS-004后未見抗病毒效果。Melo等[44]研發(fā)了一種經(jīng)LNP遞送的編碼HIV胚系靶向抗原eOD-GT8的mRNA疫苗，該疫苗在小鼠中能誘導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)以抵御HIV的感染。

狂犬病屬于致命性的急性傳染病。CV7201是由編碼狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的mRNA與陽離子蛋白魚精蛋白以游離和絡(luò)合的形式組成的一種凍干、溫度穩(wěn)定的mRNA疫苗，皮內(nèi)或肌肉注射此疫苗于動物體內(nèi)可誘導(dǎo)特異性、長期和保護(hù)性的B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)[45]，且Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明無論給藥方式還是給藥途徑都是安全的，但僅在使用無針裝置皮下或肌肉注射時具有免疫原性[34]。這些證據(jù)提示：CV7201作為預(yù)防狂犬病的mRNA疫苗有著良好前景。目前由同一公司研發(fā)的CV7202疫苗，即經(jīng)LNP遞送的編碼狂犬病病毒糖蛋白的mRNA疫苗已啟動Ⅰ期臨床試驗(yàn)[7]。

4.1.2 DNA病毒感染性疾病 巨細(xì)胞病毒(CMV)和人乳頭狀瘤病毒(HPV)都屬于DNA病毒。CMV感染是一種常見感染，可垂直傳播給胎兒，是引起新生兒先天缺陷和智力發(fā)育不全最主要的病原體之一。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究表明：接種負(fù)載編碼人巨細(xì)胞病毒pp65蛋白mRNA的DCs疫苗后，2/3的受試者能誘導(dǎo)或擴(kuò)大CMV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)[46]。John等[47]研發(fā)了一種LNP遞送的編碼有HCMV糖蛋白B和5種不同亞基(gH、gL、UL128、UL130和UL131A)組成的五聚體復(fù)合物的mRNA疫苗，在小鼠和非人靈長類動物中產(chǎn)生了有效和持久的中和抗體。目前已有核酸修飾的LNP封裝的mRNA疫苗(mRNA-1647)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)[7]。HPV16感染與多種癌癥有關(guān)，其轉(zhuǎn)化活性主要取決于病毒癌蛋白E6和E7的表達(dá)，Grunwitz等[48]研發(fā)了一種可經(jīng)靜脈給藥的脂質(zhì)體遞送的編碼有E6和E7基因的mRNA疫苗，用此疫苗免疫小鼠可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性免疫反應(yīng)。

4.2 mRNA疫苗在細(xì)菌感染性疾病中的應(yīng)用

在細(xì)菌感染性疾病中，針對鏈球菌和結(jié)核桿菌感染的疫苗研究較多。SLOdm抗原和BP-2a抗原分別在A族鏈球菌(GAS)和B族鏈球菌(GBS)的致病中起著關(guān)鍵作用。Maruggi等[49]在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：接種CNE遞送編碼SLOdm或BP-2a抗原的SAM疫苗后都能產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。65 kD熱休克蛋白(HSP65)是結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染過程中的主要免疫反應(yīng)蛋白之一。Lorenzi等[50]研發(fā)了一種經(jīng)鼻內(nèi)給藥的編碼HSP65蛋白的mRNA疫苗，研究表明小鼠接種該疫苗后可免受結(jié)核分枝桿菌毒力菌株的感染，且這種鼻內(nèi)給藥途徑可減輕小鼠肺部細(xì)菌負(fù)荷和炎癥。

4.3 mRNA疫苗在寄生蟲感染性疾病中的應(yīng)用

mRNA疫苗在寄生蟲感染中應(yīng)用較少。Chahal等[51]利用樹狀大分子納米粒子(MDNP)遞送編碼GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A和AMA1等6種特異性抗原的SAM疫苗接種小鼠，能保護(hù)其免受致死性弓形蟲的感染。Duthie等[52]發(fā)現(xiàn)用編碼杜氏利士曼原蟲LEISH-F2基因的SAM疫苗與一種亞單位疫苗聯(lián)用后，可顯著減輕肝臟寄生蟲負(fù)擔(dān)。Baeza等[53]發(fā)現(xiàn)利用編碼瘧原蟲巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(PMIF)的SAM疫苗可以產(chǎn)生PMIF特異性免疫反應(yīng)，從而獲得抗瘧疾感染的保護(hù)性免疫，此疫苗還可以增強(qiáng)對瘧原蟲的控制，防止再次感染。

5 mRNA疫苗的發(fā)展前景

mRNA疫苗無需進(jìn)入細(xì)胞核，沒有整合基因組的風(fēng)險，生產(chǎn)合成高效快速、成本低，可同時激活MCHⅠ和MCHⅡ途徑從而誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，且自身具有免疫佐劑作用，使其有望成為預(yù)防感染性疾病大流行的有力工具。盡管mRNA疫苗有著巨大的應(yīng)用前景，mRNA疫苗的發(fā)展也存在一些風(fēng)險，如mRNA疫苗在動物模型和人體內(nèi)應(yīng)用的安全性和有效性數(shù)據(jù)存在較大差異，此外mRNA疫苗還可能引起一些副作用如局部和全身炎癥，還有非原生核苷酸及載體引入的成分所具有的潛在毒性等。因此還需充分研發(fā)mRNA疫苗以提高其穩(wěn)定性和抗原在體內(nèi)的表達(dá)，從而提高疫苗的療效；還需研發(fā)更優(yōu)良的遞送工具；mRNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明；還需要探索新的策略來開發(fā)更有效的mRNA疫苗療法，包括了解最佳給藥途徑和優(yōu)化疫苗接種劑量及次數(shù)，并且不斷拓展其在各種疾病中的應(yīng)用。