大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性核酸適配子的篩選和鑒定*

洪 昊， 李 昭， 董念國(guó)△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 4300222阜外華中心血管病醫(yī)院心血管外科，鄭州 451464

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是主要存在于骨髓組織中具有多向分化潛能甚至橫向分化潛能的一種成體干細(xì)胞，由于其取材方便、創(chuàng)傷較小，體外增殖能力強(qiáng)，易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，自體移植不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，幾乎無(wú)倫理學(xué)問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)、器官移植等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。盡管關(guān)于BMSCs生物學(xué)特性的研究越來(lái)越多，但因其缺乏特有的表面標(biāo)記分子，使得分離、篩選和鑒定較為困難，目前常用方法如密度梯度離心法、差速貼壁篩選法等均不能很好地滿足實(shí)驗(yàn)要求。此外，BMSCs在骨髓中的含量極低，只有不到0.05%的骨髓細(xì)胞能表現(xiàn)出BMSCs的特性，很難滿足組織工程研究的需要[2]。因此，建立對(duì)其進(jìn)行有效分離、篩選和鑒定的方法極為重要。本研究采取指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)[1]，獲得大鼠BMSCs的特異性核酸適配子(aptamer)，從大鼠骨髓細(xì)胞中快速分離和篩選出BMSCs，并對(duì)核酸適配子與大鼠BMSCs的結(jié)合方式及能力進(jìn)行鑒定，為其進(jìn)一步應(yīng)用于組織工程，招募、捕獲靶細(xì)胞提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM低糖培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone)，胎牛血清(美國(guó)Gibco)，0.25% EDTA-Trypsin(美國(guó)Gibco)，青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco)，BSA(美國(guó)Sigma)，抗大鼠CD29、CD31、CD45、CD90抗體(美國(guó)Abcam)，DNA文庫(kù)、上游引物、下游引物、FAM-上游引物、Biotin-下游引物(美國(guó)Invitrogen)，HiFi SuperMix(日本TaKaRa)，100 bp DNA ladder(日本TaKaRa)，DNA產(chǎn)物純化試劑盒(日本TaKaRa)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(日本TaKaRa)，TA克隆試劑盒(美國(guó)Invitrogen)，X-gal(美國(guó)Invitrogen)，酵母tRNA(美國(guó)Invitrogen)，Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠、磁力架及磁珠緩沖液(美國(guó)Invitrogen)。Balb/c小鼠來(lái)源BMSCs(美國(guó)ScienCell)，人來(lái)源BMSCs(美國(guó)ScienCell)。健康4周齡SD大鼠4只，SPF級(jí)(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 大鼠BMSCs的制備

頸椎脫臼法處死大鼠(SD大鼠，4周齡)，無(wú)菌條件下取股骨和脛骨，用PBS沖洗3次。剪掉股骨和脛骨兩端干骺端，顯露骨髓腔，用無(wú)菌注射器吸取配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖出的骨髓制成單細(xì)胞懸液，離心后丟棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。差速貼壁法純化，第72 h全量換液后每2～3天全量換液。第7～10天第1次傳代，之后每6天傳代1次。取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs，制成細(xì)胞懸液，分別加入抗大鼠CD29、CD31、CD45、CD90抗體，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Bioscience公司)檢測(cè)抗體表達(dá)。

1.3 SELEX

1.3.1 DNA文庫(kù)及引物的設(shè)計(jì) 本研究的起始DNA文庫(kù)及所用引物(美國(guó)Invitrogen公司)序列為：5′-ATACCAGCTTATTCAATT-60-nt-AGATAGTAAGTGCAATCT-3′；上游引物：5′-ATACCAGCTTATTCAATT-3′；下游引物：5′-AGATTGCACTTACTATCT-3′。首先進(jìn)行PCR最佳循環(huán)數(shù)及退火溫度的優(yōu)化，反應(yīng)體系包括HiFi SuperMix(2×) 50 μL，上、下游引物(均為100 μmol/L)各0.4 μL，模板10 μL，加水至總體積100 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，分別進(jìn)行16、18、20、23、25輪循環(huán)；最后72℃延伸10 min。選擇明亮清晰、沒(méi)有非特異性擴(kuò)增條帶對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為擴(kuò)增最佳循環(huán)數(shù)。對(duì)PCR擴(kuò)增退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)條件如前所述，循環(huán)數(shù)取前述實(shí)驗(yàn)確定的最佳循環(huán)數(shù)，退火溫度分別為：49℃、50℃、51℃、52℃、53℃，產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，確定最佳退火溫度。

1.3.2 SELEX反復(fù)篩選獲得各輪DNA文庫(kù) 取第3代SD大鼠BMSCs制成細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將DNA文庫(kù)與靶細(xì)胞在1 mL篩選緩沖液中混合，孵育、離心后得到細(xì)胞沉淀，然后純化DNA，使用獲得的DNA進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系含HiFi SuperMix(2×) 180 μL，F(xiàn)AM-上游引物(100 μmol/L)25 μL，Biotin-下游引物(100 μmol/L)25 μL，模板500 μL，加水至總體積1 mL，反應(yīng)條件同上述優(yōu)化條件。磁珠洗滌，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260 nm波長(zhǎng)處單鏈DNA(ssDNA)的濃度，至此SELEX第1輪篩選結(jié)束，產(chǎn)物于-20℃條件下貯存。取第1輪獲得的ssDNA作為第2輪篩選的DNA文庫(kù)，重復(fù)上述各步驟，反復(fù)進(jìn)行篩選，獲得各輪適配子。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各輪文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合用0.25%胰酶消化貼壁生長(zhǎng)的第3代BMSCs，收集細(xì)胞懸浮液、計(jì)數(shù)、離心，加入篩選洗脫液沖洗2次，用篩選緩沖液重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度達(dá)到1×106/μL。每個(gè)流式管中加入50 μL細(xì)胞懸液和待檢測(cè)的DNA文庫(kù)，DNA終濃度均為200 nmol/L，隨后在37℃恒溫?fù)u床孵育30 min，篩選洗脫液沖洗2次，加入200 μL篩選緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各流式管中細(xì)胞熒光強(qiáng)度，以未篩選DNA文庫(kù)(lib)作為陰性對(duì)照組。

1.3.4 熒光共聚焦成像檢測(cè)各輪文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合 用0.25%胰酶消化貼壁生長(zhǎng)的第3代BMSCs，收集細(xì)胞懸浮液，接種細(xì)胞于鋪有細(xì)胞爬片的6孔板內(nèi)；培養(yǎng)3 d后，加入1 mL PBS沖洗2次，用1～2 mL 4%多聚甲醛固定15 min；固定結(jié)束后加入PBS沖洗3遍，用1%BSA封閉30 min；加入PBS沖洗2次，隨后分別加入未篩選DNA文庫(kù)、第5輪文庫(kù)及第9輪文庫(kù)孵育60 min；加入PBS沖洗2次，DAPI染液染色5～10 min；加入PBS沖洗3次，滴甘油緩沖液1滴，封片，熒光顯微鏡拍照。

1.3.5 克隆測(cè)序及候選適配子的確定 使用BioEdit軟件對(duì)所有序列進(jìn)行分析，將重復(fù)次數(shù)在2次及2次以上的所有序列挑選出來(lái)，使用RNA structure對(duì)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)與靶細(xì)胞結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度以及空白細(xì)胞組的熒光強(qiáng)度，按公式(Faptamer-Fcell)/(Flib-Fcell)計(jì)算每個(gè)序列與靶細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3.6 候選適配子與靶細(xì)胞解離常數(shù)Kd的定量 將候選適配子分別稀釋成0、4、8、16、32、64、128、256 nmol/L的濃度，取第3代SD大鼠BMSCs制成細(xì)胞懸浮液，分別加入不同濃度候選適配子，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以未篩選文庫(kù)作為陰性對(duì)照。統(tǒng)計(jì)每個(gè)濃度候選適配子與靶細(xì)胞結(jié)合后的平均熒光強(qiáng)度，去除背景的熒光強(qiáng)度，與適配子的濃度代入公式Y(jié)=BmaxX/(Kd+X)中，使用SigmaPlot軟件繪制解離曲線，測(cè)得每個(gè)候選適配子對(duì)BMSCs的Kd值。

1.3.7 適配子apt7的細(xì)胞選擇性 分別取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs(分別為SD大鼠、Balb/c小鼠以及人來(lái)源)，制成細(xì)胞懸液，加入適配子apt7，DNA終濃度為200 nmol/L，37℃搖晃孵育30 min；離心并沖洗2次，200 μL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管中，4℃避光保存，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以大鼠外周血單核細(xì)胞(PBMCs)作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的制備

培養(yǎng)5～7 d的BMSCs形態(tài)見(jiàn)圖1。細(xì)胞傳至第3代時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SD大鼠BMSCs表面分子標(biāo)記CD29、CD31、CD45、CD90，其中CD29(97.9%)及CD90(99.1%)表達(dá)陽(yáng)性，CD31(4.56%)及CD45(5.50%)表達(dá)陰性，與國(guó)際上公認(rèn)的BMSCs表型一致，證明本研究獲取的BMSCs純度已達(dá)到較高水平，可以作為靶細(xì)胞用于適配子篩選。

圖1 大鼠BMSCs在光鏡下呈扁平紡錘狀(×100)Fig.1 BMSCs of rats show a flat spindle-like morphology under light microscope(×100)

2.2 基于SELEX的大鼠BMSCs特異性適配子篩選

PCR優(yōu)化的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，分別進(jìn)行16、18、20、23、25輪循環(huán)；最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示25輪可作為PCR的最佳循環(huán)數(shù)。進(jìn)一步對(duì)PCR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，退火溫度分別為：49℃、50℃、51℃、52℃、53℃，結(jié)果顯示53℃為PCR的最佳退火溫度。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各輪DNA文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合

SELEX每2輪篩選采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各輪DNA文庫(kù)與BMSCs的結(jié)合能力，用未篩選DNA文庫(kù)(lib)作為陰性對(duì)照(圖2)。隨著篩選的進(jìn)行，與BMSCs特異性結(jié)合的序列逐漸保留下來(lái)，得到擴(kuò)增，非特異性序列逐漸被丟棄，文庫(kù)與BMSCs結(jié)合能力逐漸上升，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度升高，對(duì)應(yīng)的流式曲線右移。在前7輪篩選中BMSCs細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度顯著增加，提示隨著篩選的反復(fù)進(jìn)行，特異性序列得到極大的富集。第9輪篩選文庫(kù)與細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度同第7輪相比并沒(méi)有顯著的增加，提示特異性序列已得到最大程度的富集，繼續(xù)進(jìn)行篩選反而會(huì)導(dǎo)致特異性序列的丟失，因此，我們認(rèn)為BMSCs特異性適配子在第9輪獲得最大程度的擴(kuò)增與富集。

藍(lán)色為抗體標(biāo)記組，紅色為空白對(duì)照組

2.4 共聚焦成像觀察DNA文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合

用未篩選DNA文庫(kù)、第5輪DNA文庫(kù)與第9輪DNA文庫(kù)分別與DAPI同時(shí)對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行染色(圖3)。共聚焦結(jié)果顯示，第9輪DNA文庫(kù)染色細(xì)胞的表面綠色熒光最強(qiáng)，提示該輪BMSCs特異性適配子得到最大程度地富集；第5輪文庫(kù)染色細(xì)胞的綠色熒光較為微弱，未篩選文庫(kù)組幾乎看不到綠色熒光表達(dá)，提示第5輪文庫(kù)中特異性適配子的富集程度高于未篩選文庫(kù)，但二者都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于第9輪文庫(kù)。因此，BMSCs特異性適配子序列在第9輪得到最大程度地富集。

aptamer：適配子；lib：未篩選DNA文庫(kù)；5th round pool：第5輪DNA文庫(kù)；9th round pool：第9輪DNA文庫(kù)

2.5 克隆測(cè)序及候選適配子的確定

對(duì)第9輪文庫(kù)進(jìn)行克隆，使用BioEdit軟件對(duì)所有序列進(jìn)行分析(圖4)，將重復(fù)次數(shù)在2次及2次以上的所有序列挑選出來(lái)，獲得8條序列分別為：apt7、apt9、apt31、apt32、apt61、apt83、apt99、apt101(表1)，使用RNA structure軟件對(duì)每條序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖5)。8條序列5′端均插入熒光基團(tuán)FAM修飾。8條帶熒光標(biāo)記的序列分別與靶細(xì)胞BMSCs孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。所有序列的熒光強(qiáng)度都顯著超過(guò)對(duì)照組lib，其中，apt7與BMSCs的結(jié)合能力最強(qiáng)，曲線右移程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它序列，apt101與靶細(xì)胞的結(jié)合能力次之。分別統(tǒng)計(jì)lib、apt7、apt9、apt31、apt32、apt61、apt83、apt99、apt101與靶細(xì)胞結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度以及空白細(xì)胞組(不加入任何熒光標(biāo)記序列)的熒光強(qiáng)度，按公式(Faptamer-Fcell)/(Flib-Fcell)計(jì)算每個(gè)序列與靶細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖7所示，8個(gè)候選適配子中apt7與BMSCs結(jié)合的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，apt101次之。

表1 候選適配子序列Table 1 Candidate sequences of aptamers

圖4 使用BioEdit軟件進(jìn)行序列分析Fig.4 Sequence analysis using BioEdit software

圖5 各候選適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of the secondary structure of each candidate aptamer

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)候選適配子與BMSCs的結(jié)合Fig.6 Detection of binding of candidate aptamer to BMSCs by flow cytometry

圖7 不同候選適配子與BMSCs結(jié)合能力的比較Fig.7 Comparison of the binding ability of different aptamers to BMSCs

2.6 候選適配子與靶細(xì)胞解離常數(shù)Kd的定量

8個(gè)候選適配子Kd值均在納摩爾級(jí)別，對(duì)靶細(xì)胞具有高親和力，其中apt7的Kd值最小，僅有(11.79±0.72)nmol/L，表明適配子apt7與BMSCs的親和力是所有候選適配子中最高的(圖8)。

圖8 不同濃度apt與BMSCs結(jié)合及解離曲線Fig.8 Binding and dissociation curves of different concentrations of apts to BMSCs

2.7 熒光共聚焦成像觀察候選適配子與靶細(xì)胞的結(jié)合

取候選適配子中與靶細(xì)胞Kd值最小的3個(gè)序列：apt7、apt61、apt101，每條序列5′端插入熒光基團(tuán)FAM修飾，與BMSCs孵育30 min后，沖洗2次去除未結(jié)合適配子，然后用DAPI染液進(jìn)行細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡下觀察3組靶細(xì)胞表面均有明亮的綠色熒光表達(dá)。結(jié)果表明候選適配子apt7、apt61、apt101能穩(wěn)定地結(jié)合在靶細(xì)胞表面，與靶細(xì)胞均有高親和力(圖9)。

圖9 apt7、apt61、apt101在BMSCs表面的結(jié)合(×200)Fig.9 Binding of apt7，apt61，and apt101 on the surface of BMSCs(×200)

2.8 apt7的細(xì)胞選擇性實(shí)驗(yàn)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，apt7能與大鼠來(lái)源的BMSCs高親和力結(jié)合，對(duì)人及小鼠來(lái)源的BMSCs無(wú)親和力(圖10)。

圖10 apt7與不同來(lái)源BMSCs細(xì)胞的結(jié)合Fig.10 Binding of apt7 to BMSCs from different sources

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了一種新的BMSCs篩選和鑒定分子，即適配子。它是人工合成的小分子配體，能與靶目標(biāo)高親和力、高特異性結(jié)合，通常為小分子的單鏈DNA或RNA寡核苷酸序列，長(zhǎng)度通常在100個(gè)堿基之內(nèi)，可采用SELEX技術(shù)從構(gòu)建的隨機(jī)核酸文庫(kù)中篩選出來(lái)[3-4]。

核酸適配子的篩選過(guò)程從構(gòu)建核酸初始文庫(kù)開(kāi)始，將構(gòu)建好的文庫(kù)與靶分子混合孵育，采用離心、柱層析法、免疫吸附法等分離技術(shù)去除文庫(kù)中無(wú)法與靶分子緊密結(jié)合的序列，隨后，靶分子表面的核苷酸經(jīng)過(guò)洗脫、PCR擴(kuò)增等操作繼續(xù)用于下一輪的篩選，整個(gè)過(guò)程重復(fù)進(jìn)行直至獲得特異性高的適配子序列[5]。與其它靶向分子比較，適配子具有顯著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，適配子從隨機(jī)、多樣、大容量的文庫(kù)中經(jīng)過(guò)反復(fù)數(shù)輪篩選得到，對(duì)靶分子的結(jié)合具有高特異性及高親和力，Kd可達(dá)到納摩爾級(jí)別[6]。適配子篩選耗費(fèi)時(shí)間短，在體外可以用化學(xué)方法合成，穩(wěn)定性好，易于插入各種官能團(tuán)和基團(tuán)如生物素、羧基、氨基等[7-8]，擴(kuò)展了適配子的應(yīng)用范圍，而且這種修飾不影響適配子對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別能力。獨(dú)特的篩選技術(shù)使適配子識(shí)別靶分子范圍極其廣泛，包括小分子的金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸和抗生素，甚至各種大分子的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、病毒以及細(xì)菌等等都可作為篩選的靶目標(biāo)，靶標(biāo)的多樣性也使適配子在生物信息學(xué)、醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。

適配子篩選最重要的靶標(biāo)之一是活細(xì)胞，寡核苷酸序列通過(guò)三維空間構(gòu)象牢牢結(jié)合在靶細(xì)胞的表面，細(xì)胞膜表面任何一個(gè)分子都有可能是適配子結(jié)合的潛在靶點(diǎn)，隨著篩選的反復(fù)進(jìn)行和篩選條件逐漸變得嚴(yán)苛，適配子與靶細(xì)胞之間形成特異性結(jié)合的保留下來(lái)，非特異性結(jié)合則直接被淘汰。

在本研究中，隨著SELEX篩選的反復(fù)進(jìn)行，靶點(diǎn)特異性適配子從核酸文庫(kù)中篩選出來(lái)。為滿足各種各樣研究要求，不同類型的SELEX，如counter-SELEX、AFM-SELEX、Photo-SELEX、CE-SELEX等逐漸出現(xiàn)[9-10]，其中以活細(xì)胞為靶點(diǎn)的Cell-SELEX已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像、疾病的檢測(cè)和治療等方面[11-12]。使用Cell-SELEX技術(shù)篩選出的內(nèi)皮祖細(xì)胞特異性適配子具有較高的親和力，研究表明，在流體環(huán)境下該適配子具有捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞的能力，為用于構(gòu)建血管支架材料提供了依據(jù)[13]。在本研究中我們以SD大鼠BMSCs為靶細(xì)胞，通過(guò)9輪SELEX篩選獲得DNA富集文庫(kù)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明文庫(kù)與BMSCs結(jié)合的熒光表達(dá)強(qiáng)度與未篩選文庫(kù)相比顯著增高，共聚焦成像顯示文庫(kù)能穩(wěn)定結(jié)合在BMSCs表面，這些結(jié)果都進(jìn)一步說(shuō)明適配子篩選的過(guò)程具有特異性，BMSCs特異性適配子在第9輪達(dá)到最大程度的富集。

以細(xì)胞為靶點(diǎn)篩選特異性適配子是一種“盲篩”，研究人員不需要提前了解靶細(xì)胞的表面標(biāo)記分子或膜蛋白的組成，特別是在缺乏特異性分離或鑒定方法的活細(xì)胞招募中是一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)[14]。本研究中，對(duì)富集文庫(kù)進(jìn)行克隆及測(cè)序后獲得了8個(gè)候選適配子，與未篩選文庫(kù)相比，8個(gè)候選適配子對(duì)BMSCs都有較高的親和力，其中適配子apt7的Kd僅有(11.79±0.72)nmol/L，對(duì)大鼠BMSCs親和力最高，我們決定選取apt7對(duì)適配子的特性作進(jìn)一步的研究。

核酸適配子最重要的特性之一是靶點(diǎn)特異性。細(xì)胞選擇性實(shí)驗(yàn)表明適配子apt7能高親和力結(jié)合大鼠BMSCs，對(duì)小鼠、人來(lái)源的BMSCs沒(méi)有親和力，我們猜測(cè)apt7能與大鼠BMSC膜表面某種蛋白結(jié)合，而這種蛋白不存在小鼠或人來(lái)源BMSCs細(xì)胞表面。因此，apt7可作為分子工具研究大鼠BMSCs表面的特殊分子標(biāo)記，必要時(shí)可作為大鼠BMSCs組織學(xué)特征用于鑒定。在另外一項(xiàng)有趣的研究中，Jiang等[15]篩選出人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPS)的核酸適配子apt19S，apt19S與IPS親和力很高，研究人員利用細(xì)胞表型分析及基因敲除等技術(shù)發(fā)現(xiàn)apt19S能與IPS膜表面蛋白堿性磷酸酶配體(ALPL)高親和力結(jié)合，認(rèn)為ALPL不僅是適配子apt19S的一個(gè)作用位點(diǎn)，還能作為IPS特殊分子標(biāo)記用于對(duì)IPS特性的研究中。此外，適配子在體內(nèi)的血液殘留時(shí)間短、無(wú)免疫原性、毒性低、分子小、擴(kuò)散快速、體內(nèi)清除快等特點(diǎn)使其適合進(jìn)行體內(nèi)研究[16]，如適配子與納米材料耦合用于腫瘤細(xì)胞成像中[11]，以及基于適配子的靶向載藥體系在疾病治療中的應(yīng)用等[17]。

本研究采用SELEX篩選技術(shù)，獲得了大鼠BMSCs的特異性核酸適配子，建立了新的從大鼠骨髓細(xì)胞中快速篩選和鑒定BMSCs的方法，為BMSCs在體內(nèi)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制的研究，以及為組織工程支架研究中招募、捕獲靶細(xì)胞等環(huán)節(jié)提供了新的思路和方法。