瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6及組織中caspase-3基因表達的影響

孫華，肖開永，劉利君

急性心肌梗死（AMI）是指冠狀動脈（冠脈）急性、持續(xù)性缺血缺氧所導致的心肌壞死，可導致惡性心律失常、休克或心力衰竭等，嚴重威脅患者的生命安全[1]。研究表明，心肌纖維化為心力衰竭（心衰）的獨立危險因素之一，AMI后阻斷心肌纖維化進程是防治心衰的關鍵，而心肌纖維化與炎性反應及細胞凋亡有關[2]。瑞舒伐他汀是他汀類降血脂藥，其在抑制氧化應激、細胞凋亡、心肌纖維化等方面作用逐漸被證實[3]。本研究擬通過探討瑞舒伐他汀對AMI大鼠血清C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎性因子及組織中細胞凋亡相關基因caspase-3表達情況影響，為其治療相關機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 40只雄性清潔級健康SD大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，平均（220±20）g；瑞舒伐他汀[阿斯利康藥業(yè)（中國）有限公司，國藥準字J20170008，規(guī)格：10 mg]；大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；SP免疫組化檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體購自艾美捷科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型構建及分組 根據文獻[4]步驟構建大鼠AMI模型：腹腔注射3%戊巴比妥鈉，固定四肢，氣管插管，插管遠端連接小動物呼吸機，四肢皮下連接心電記錄儀，第3肋肋間離斷行開胸術，充分暴露心臟，左心耳下進針縫扎前降支。建模成功標準：結扎處左心室組織呈蒼白色，心電圖ST-T段呈弓背上抬高。無出血后，逐層縫合關胸。Sham組大鼠僅行前降支穿線而不結扎。術后24 h再行心電圖檢查證實AMI情況。建模成功后將術后24 h內存活的21只模型大鼠隨機分為模型組（Model組，10只）、瑞舒伐他汀組（11只）。術后1 d起，Sham、Model組予以1 mg/kg·d生理鹽水灌胃處理，瑞舒伐他汀組予以1 mg/kg·d瑞舒伐他汀灌胃處理，連續(xù)用藥4周。

1.2.2 標本采集 血清標本：大鼠麻醉后，采集3 ml心臟血，3000 r/min離心處理15 min，分離血清，于-80℃冷存待檢。組織標本：干預4周后，大鼠麻醉稱重，斷頭處死，快速開胸，摘除心臟，生理鹽水反復沖洗，采集近基底部梗死區(qū)心肌組織，置入中性福爾馬林溶液內固定24 h，石蠟包埋，制成4 μm切片。

1.2.3 血清CRP、TNF-α、IL-6水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測待測血清標本中的CRP、TNF-α、IL-6水平，采用美國Bio Tek ELx800全自動酶標儀于450 nm波長處測得待測標本吸光度（OD）值，并繪制標準品回歸曲線，以OD值計算出待測標本濃度，嚴格按照試劑盒及儀器說明書進行操作。

1.2.4 心肌組織caspase-3基因表達檢測 caspase-3蛋白檢測：免疫組化SP法：①石蠟切片，常規(guī)脫蠟；②高壓抗原修復；③阻斷滅活內源性過氧化物酶；④滴加羊血清封閉；⑤滴加采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋至1:100兔抗大鼠caspase-3一抗，PBS沖洗；⑥滴加經辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗；⑦滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶（SP）；⑧二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色；⑨蘇木素復染；⑩脫水、透明、封片、鏡檢。設置PBS代替一抗為陰性對照。每份標本取3張切片，顯微鏡下評估caspase-3蛋白表達情況，判定標準[5]為：細胞核、細胞漿內存在棕黃色、棕褐色顆粒即為陽性。采用病理圖形文字分析軟件測定陽性細胞表達區(qū)，每張切片選擇4個陽性表達區(qū)內視野，每個視野計數200個caspase-3蛋白陽性染色，該數值代表caspase-3基因蛋白表達水平，蛋白陽性指數（PI）=（陽性細胞數/視野內細胞總數）×100%。

caspase-3基因半定量分析：RT-PCR法：總RNA提取及cDNA逆轉錄合成均按照文獻[6]所述進行。PCR擴增：檢索基因庫中大鼠caspase-3基因的cDNA序列，以β-actin為內參進行擴增，引物序列為：caspase-3：上游引物：5’-CTGGACTG CGGTATTGAGAC-3’，下游引物：5’-CCGGGT GCGGTAGAGTAAGC-3’，β-actin：上游引物：5’-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游引物：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3’。反應體系為：2.5 μl cDNA+2.5 μl PCR緩沖液+0.1 μl上游引物+0.1 μl下游引物+7.2 μl滅菌水+0.1 μl Taq酶+2 μl dNTP。反應條件為：預變性：95℃，40 s→60℃，40 s→72℃，1 min，共36個循環(huán)，再72℃反應10 min冷存待檢。以caspase-3/β-actin值表示caspase-3基因的mRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 數據采用SPSS 22.0軟件處理。正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，三組間比較行單因素方差分析，兩兩對比采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較 結果顯示，Model組、瑞舒伐他汀組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平均高于Sham組，瑞舒伐他汀組血清CRP、TNF-α、IL-6水平均低于Model組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），（表1、圖1）。

2.2 三組心肌組織caspase-3基因表達情況比較 結果顯示，Model組、瑞舒伐他汀組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽性指數、mRNA表達水平均高于Sham組大鼠，而瑞舒伐他汀組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽性指數、mRNA表達水平均低于Model組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），（表2、圖2）。

表1 三組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較

圖1 三組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較

表2 三組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽性指數、mRNA表達水平比較

圖2 三組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽性指數、mRNA表達水平比較

3 討論

心力衰竭是包括AMI在內的多種心血管疾病終末階段，死亡率較高。研究顯示，心力衰竭誘發(fā)心肌細胞外基質纖維化及心肌細胞損傷為AMI患者心功能惡化的基礎病因[7]。心肌損傷時，其成纖維細胞大量分泌并生成肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞會產生過量膠原蛋白，致使心肌細胞外基質異常沉積，引發(fā)心肌纖維化，并最終引起心室重構，心功能惡化[8]。

既往研究認為，他汀類藥物主要用于降血脂，降低心腦血管疾病風險。近年研究顯示，他汀類藥物除降脂外還具有如抗動脈粥樣硬化，抑制血栓形成、免疫應答、氧化應激、心肌細胞凋亡及改善心功能等多重效應[9,10]。瑞舒伐他汀作為一類常用他汀藥物，具有比其他他汀藥物作用更強、作用時間更長的特點。戚鳳君等[11]研究顯示，瑞舒伐他汀可明顯降低經皮冠狀動脈介入治療（PCI）后患者血清炎性因子水平。謝亞芹等[12]研究則表明，瑞舒伐他汀能明星降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡相關基因表達水平。因此，本研究通過構建大鼠AMI模型，探討瑞舒伐他汀對AMI炎性因子及細胞凋亡的影響。

已有研究證實，炎性因子在AMI患者心肌纖維化進程中扮演重要角色。CRP為一種急性時相蛋白，被證實和心力衰竭、心肌梗死、高血壓等發(fā)生有關。張立杰等[13]指出，CRP能以激活核轉錄因子信號通路、轉化生長因子-β1信號通路及上調血管緊張素Ⅱ受體水平參與炎性反應，從而引發(fā)心肌纖維化。TNF-α為啟動炎性反應最為重要的細胞因子，也稱為前炎癥細胞因子。陳強等[14]表明，TNF-α會抑制心肌收縮過程β受體活性及Ca2+活動，誘使心肌細胞、間質結構發(fā)生改變，從而損傷心肌功能。IL-6為一種主要由成纖維細胞、單核細胞分泌的細胞因子，具有多重效應，在機體免疫代謝過程中起關鍵作用。陳澤江等[15]研究顯示，IL-6能誘導肝細胞分泌CRP，且此過程在炎癥早期便可發(fā)生，促使血栓形成及纖維蛋白原分泌而損傷心肌細胞；此外，IL-6還誘導TNF-α水平升高而致使血管、內皮細胞功能異常，促使局部黏附因子聚集，導致心肌纖維化。本研究表明，Model組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯高于Sham組大鼠，而瑞舒伐他汀組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯低于Model組，提示瑞舒伐他汀能降低血清CRP、TNF-α、IL-6水平，從而抑制心肌纖維化進程，改善心肌功能。

張杰等[16]研究顯示，細胞凋亡與AMI發(fā)生有關。心肌細胞為不可再生細胞，AMI早期伴隨大量心肌細胞凋亡，而當凋亡水平超過周圍細胞及局部巨噬細胞清除水平時，未被吞噬凋亡細胞會壞死、裂解，釋放大量炎性因子，造成心肌實質細胞丟失，導致心室重構，進一步損傷心肌。細胞凋亡主要存在內源性途徑及外源性途徑兩種相互關聯(lián)途徑，目前已發(fā)現caspase家族中的caspase-3參與了上述兩種途徑的細胞凋亡調控過程。caspase-3為細胞凋亡中級聯(lián)反應最后通路，可直接引發(fā)細胞凋亡，也可通過破壞DNA修復相關酶、細胞骨架蛋白與其調節(jié)蛋白結構，抑制DNA修復，促使細胞凋亡[17]。本研究表明，Model組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽性指數、caspase-3 mRNA表達水平均明顯高于Sham組大鼠，而瑞舒伐他汀組大鼠心肌組織caspase-3蛋白陽性指數、caspase-3 mRNA表達水平均明顯低于Model組大鼠，提示瑞舒伐他汀可明顯抑制caspase-3基因表達，從而抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，瑞舒伐他汀可明顯降低急性心肌梗死大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平，抑制心肌纖維化，下調心肌組織中caspase-3基因表達，從而抑制心肌細胞凋亡，改善大鼠心肌功能。