急性心肌梗死患者血清微小RNA-143、環(huán)氧化酶2表達(dá)與心血管事件發(fā)生的相關(guān)性研究

王紅，姜濤，石云霄

急性心肌梗死（心梗）是常見(jiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病，其主要發(fā)生機(jī)制為冠狀動(dòng)脈（冠脈）粥樣硬化導(dǎo)致新生血栓，引起血管急性閉塞，導(dǎo)致心肌持續(xù)性缺血造成心肌急性壞死[1]。急性心梗在臨床上十分常見(jiàn)，已成為威脅人類生命的殺手。有研究報(bào)道，炎癥反應(yīng)是促發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化血管血栓破裂的主要原因[2]。急性心梗后患者出現(xiàn)左室重構(gòu)，會(huì)導(dǎo)致心肌收縮功能降低，影響預(yù)后。微小RNA（microRNA）已成為心血管疾病中的研究熱點(diǎn)，在與心臟組織有關(guān)的多種疾病中（例心梗、肥厚性心肌病、心力衰竭等）均發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[3]。Yu等[4]發(fā)現(xiàn)miR-143表達(dá)增加可通過(guò)減少炎癥反應(yīng)來(lái)減輕心肌肥大。原平等[5]發(fā)現(xiàn)急性心梗時(shí)，平滑肌細(xì)胞大量調(diào)亡，miR-143通過(guò)抑制細(xì)胞增殖從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分化。Liu等[6]發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶2（COX-2）是miR-143的下游基因，COX-2在心肌梗死患者心肌細(xì)胞中異常表達(dá)。龍作鵬[7]研究發(fā)現(xiàn)COX-2與血管平滑肌細(xì)胞的功能有關(guān)，同時(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞炎性因子生成，促進(jìn)急性心肌梗死疾病的病情進(jìn)展。本研究擬探討miR-143、COX-2的表達(dá)情況，旨為明確其在急性心梗發(fā)展中的作用及對(duì)心血管事件發(fā)生的預(yù)判。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年6月至2019年6月于開(kāi)封市中醫(yī)院收治的急性心肌梗死患者93例為研究對(duì)象，年齡30~82歲，均經(jīng)心電圖顯示為ST段抬高型心肌梗死，合并高血壓41例，糖尿病45例，納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》2015修訂版中診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]?；颊呔腥毖孕赝磁R床病史且發(fā)作持續(xù)時(shí)間≥30 min并接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前接受抗炎藥物治療患者；患有惡性腫瘤、嚴(yán)重肝、腎功能異?；颊?；患有自身免疫性疾病患者；無(wú)法手術(shù)者。另選擇同期健康體檢者100例為對(duì)照組，年齡32~85歲。本研究經(jīng)受試者及家屬知情同意，簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組患者在性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）及合并基礎(chǔ)疾病等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。心梗組血清總膽固醇、低密度脂蛋白高于對(duì)照組（P＜0.05），表1。

1.2 試劑與儀器 COX-2 ELISA試劑盒（貨號(hào)：JKSJ-2202），購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司；RNA SYBR Green PCR Kit（貨號(hào)：KL101-969），購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（貨號(hào)：R1200-100），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SYBR? Green Quantitative RT-qPCR Kit（貨號(hào)：QR0100），PrimeScript RT reagent Kit（RR047A）購(gòu)自日本Takara 公司；CFX96 qRT-PCR儀購(gòu)于德國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 所有研究對(duì)象清晨空腹時(shí)采取靜脈血5 ml，靜置20 min 4℃，3000 r/min，離心10 min，留取上清液裝于無(wú)RNA酶的EP管中，于-80℃冰箱中待測(cè)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)血清中miR-143的水平 將樣本從冰箱中取出，在超凈工臺(tái)上自然溶解，用無(wú)RNA酶試劑提取血清中總RNA進(jìn)行檢測(cè)，若OD260/OD280約1.8~2.0，表明RNA未被蛋白質(zhì)或苯酚污染，可用于后續(xù)試驗(yàn)操作，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用CFX96 qRT-PCR儀對(duì)miR-143及內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。miR-143正向引物5’-GTCGT ATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACGAGCTACA-3’，反向引物’-GTTCGT GGGTGAGATGAAGCACTG -3’；內(nèi)參U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。引物由上海生工合成。q RT-PCR反應(yīng)體系20 μl：5×SYBR Green qPCR Mix 4 μl，上下游引物各2 μl，cDNA模板2 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，ddH2O 9.6 μl。反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；57℃，30 s；72℃，1min；30個(gè)循環(huán)；72℃，5min。對(duì)miR-143相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT法計(jì)算。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血清COX-2水平，試劑盒采用COX-2 ELISA試劑盒。

1.4 隨訪 對(duì)急性心肌梗死患者隨訪6個(gè)月，統(tǒng)計(jì)6個(gè)月內(nèi)發(fā)生不良心血管事件情況，包括死亡、再次心肌梗死、嚴(yán)重心律失常和心力衰竭等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較行單因素方差分析，組內(nèi)兩組間均數(shù)相比行snk-q檢驗(yàn)，采用Pearson法分析miR-143水平與COX-2水平的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清miR-143、COX-2水平 與對(duì)照組相比，心梗組患者血清miR-143水平較低，COX-2水平較高（P＜0.05），表2。

2.2 心梗組血清miR-143和COX-2水平與術(shù)后心血管事件發(fā)生率的關(guān)系 按照miR-143平均水平將心梗組分為miR-143高水平組（39例）和miR-143低水平組（54例）。miR-143低水平組發(fā)生心血管事件發(fā)生率為31.48%（死亡4例，再次心肌梗死4例，嚴(yán)重心律失常5例，心力衰竭4例）；miR-143高水平組發(fā)生心血管事件發(fā)生率為12.82%（再次心肌梗死1例，嚴(yán)重心律失常3例，心力衰竭1例）。miR-143低水平組心血管事件發(fā)生率明顯高于miR-143高水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.366，P＜0.05）。按照COX-2平均水平將心梗組分為COX-2高水平組（51例）和COX-2低水平組（42例）。隨訪發(fā)現(xiàn)，COX-2高水平組發(fā)生心血管事件發(fā)生率為31.37%（死亡4例，再次心肌梗死3例，嚴(yán)重心律失常6例，心力衰竭3例）；COX-2低水平組發(fā)生心血管事件發(fā)生率為11.91%（再次心肌梗死2例，嚴(yán)重心律失常2例，心力衰竭1例）。COX-2高水平組心血管事件發(fā)生率明顯高于COX-2低水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.993，P＜0.05）。

表1 一般資料比較

表2 兩組患者血清miR-143、COX-2水平比較（±s）

表2 兩組患者血清miR-143、COX-2水平比較（±s）

注：COX-2：環(huán)氧化酶2

組別 例數(shù) miR-143/U6 COX-2（U/L）心梗組 93 0.74±0.21 62.37±14.95對(duì)照組 100 1.06±0.33 22.59±6.64 t值 - 7.970 24.158 P值 - 0.000 0.000

2.3 心梗組血清miR-143與COX-2相關(guān)性分析 Mirtarbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-143與COX-2存在結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。Pearson相關(guān)性分析顯示，心梗組患者血清miR-143水平與COX-2水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.734，P＜0.05），圖2。

2.4 影響心血管事件的危險(xiǎn)因素分析 多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析表明，miR-143低水平、COX-2高水平是急性心?；颊哳A(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.952，95%CI：1.227~3.106；HR=2.291，95%CI：1.304~4.026，P＜0.05），表3。

圖1 miR-143與COX-2結(jié)合位點(diǎn)

圖2 心梗組患者血清miR-143水平與COX-2水平的相關(guān)性

表3 影響急性心肌梗死患者心血管事件發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果

3 討論

急性心梗有較高的致死率，其發(fā)病機(jī)制與血管平滑肌細(xì)胞調(diào)亡、促炎癥反應(yīng)增加、心臟纖維化相關(guān)[9]。早發(fā)現(xiàn)、早治療對(duì)改善預(yù)后非常重要。

急性心梗臨床特征為心肌細(xì)胞調(diào)亡和炎癥反應(yīng)加重[10]。microRNA是內(nèi)源性非編碼RNA，可通過(guò)抑制mRNA轉(zhuǎn)錄或降解mRNA方式在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖、分化和調(diào)亡。研究報(bào)道[11,12]microRNA在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后，參與許多重要病理過(guò)程。也有研究顯示[13]microRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的多種功能參與心血管疾病的發(fā)病過(guò)程。心血管疾病的發(fā)生與心血管細(xì)胞的增殖、遷移和分化及血管生成有密切聯(lián)系，例miR-143通過(guò)對(duì)血管緊張素的調(diào)節(jié)可擴(kuò)張血管、抑制血管纖維化[14]。朱啟娥等[15]研究發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的miR-143在心血管疾病中呈高表達(dá)。文獻(xiàn)顯示[16]血管平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈血管壁的主要類型，是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)，miR-143可調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增值。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)在心?；颊叩男募〖?xì)胞中，miR-143表達(dá)水平下降，促進(jìn)心肌細(xì)胞調(diào)亡。郝理等[17]研究發(fā)現(xiàn)人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組織中miR-143水平明顯低于正常組織，但miR-143無(wú)法抑制疾病的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)心梗組患者血清中miR-143水平顯著高于健康體檢者，提示miR-143可能與急性心肌梗死的發(fā)生有關(guān)，miR-143可作為急性心肌梗死的潛在生物標(biāo)記物。

COX有2種亞型，COX-2是受某種刺激產(chǎn)生的誘導(dǎo)性酶。研究報(bào)道[18]，COX-2含量與大鼠急性心梗部位細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且COX-2表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞的調(diào)亡。Ma等[19]發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白在大鼠心肌缺血期間心臟組織中高表達(dá)的蛋白質(zhì)，且COX-2被證明與心肌梗死中細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度有關(guān)。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)COX-2的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞的調(diào)亡，而牛蒡子苷元可通過(guò)抑制COX-2高表達(dá)而發(fā)揮抗心梗的保護(hù)作用。賴永坤等[21]研究發(fā)現(xiàn)，急性心?；颊哐逯蠧OX-2水平明顯高于健康體檢者，COX-2可能成為治療冠脈綜合征的潛在靶位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)COX-2在心梗組患者血清中水平顯著高于健康體檢者，提示COX-2可能在急性心梗的發(fā)生中起到重要作用。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)在心?；颊咝募〖?xì)胞中COX-2是miR-143下游靶基因，且二者在心肌細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)。本研究通過(guò)miRtarbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-143與COX-2存在結(jié)合位點(diǎn)，且Pearson分析顯示心梗組患者血清miR-143水平與COX-2水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-143可能與COX-2共同影響急性心梗疾病發(fā)生，二者可能存在調(diào)控作用。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-143低水平組心血管事件發(fā)生率明顯高于miR-143高水平組，COX-2高水平組心血管事件發(fā)生率明顯高于COX-2低水平組，提示miR-143與COX-2可能與急性心?；颊咝g(shù)后心血管事件的發(fā)生有關(guān)，miR-143異常低表達(dá)以及COX-2異常高表達(dá)均不利于患者預(yù)后。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析表明，miR-143低水平、COX-2高水平是急性心?；颊咝难苁录l(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-143與COX-2可能對(duì)預(yù)判急性心?；颊咝难苁录闆r具有參考價(jià)值。

綜上所述，急性心?；颊哐逯衜iR-143水平下調(diào)，COX-2水平上調(diào)，miR-143、COX-2為急性心梗后心血管事件的發(fā)生評(píng)估提供理論參考[22]。但miR-143如何在急性心肌梗死中調(diào)控COX-2還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入探討。