MEI1在宮頸癌中高表達(dá)并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移侵襲*

陳麗萍， 賀曉琪

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022

宮頸癌是全球第4大最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，每年大約25萬(wàn)女性因?qū)m頸癌死亡[1]。近年來(lái)宮頸癌發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)，由于宮頸癌發(fā)病早期常無(wú)典型癥狀及體征，易誤診或漏診，嚴(yán)重威脅女性生命健康，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是其主要危險(xiǎn)因素。盡管近年來(lái)宮頸癌的預(yù)防、篩查、診斷等方面均取得明顯進(jìn)步，使宮頸癌得以早期發(fā)現(xiàn)和治療，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率明顯下降，但進(jìn)展期宮頸癌患者治療后的5年生存率仍不盡人意[2]，因此開(kāi)發(fā)可顯著抑制宮頸癌進(jìn)展，并提高宮頸癌患者生存期的治療方法迫在眉睫。減數(shù)分裂抑制物1(meiosis inhibitor 1，MEI1)首先被報(bào)道參與細(xì)胞減數(shù)分裂周期，它的表達(dá)異常可導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常并影響機(jī)體的生育能力。MEI1基因編碼1274個(gè)氨基酸，含有5個(gè)BRCT結(jié)構(gòu)域，可參與真核生物DNA的損傷修復(fù)[3]。新近有文獻(xiàn)報(bào)道HPV感染的宮頸癌組織中MEI1表達(dá)量高于HPV陰性的宮頸癌組織[4]，而MEI1在宮頸癌進(jìn)展過(guò)程中的作用尚不清楚。

宮頸癌的增殖與轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)異常激活存在密切的聯(lián)系。Cyclin D1屬于細(xì)胞周期蛋白家族的一員，通過(guò)控制細(xì)胞G1期向S期的進(jìn)展，對(duì)細(xì)胞周期起著至關(guān)重要的作用[5-6]；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)同樣參與細(xì)胞周期以及DNA復(fù)制[7-9]；EMT是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，HPV16 E6和E7感染宮頸癌細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)與EMT誘導(dǎo)相似的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)上調(diào)和E-鈣粘蛋白(E-cadherin)下調(diào)的表達(dá)水平變化[10]；E-cadherin作為上皮細(xì)胞的粘附分子，其表達(dá)下調(diào)被認(rèn)為是EMT活化的基礎(chǔ)，而金屬基質(zhì)蛋白(MMP)可進(jìn)一步降解基質(zhì)蛋白。此外，細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)上調(diào)，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供便利。

本研究分析了MEI1在宮頸癌組織及其鄰近正常組織中的表達(dá)，并通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MEI1表達(dá)量與宮頸癌患者生存期的關(guān)系，再進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討MEI1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移、侵襲能力的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 人宮頸癌細(xì)胞C-33A細(xì)胞、HCC-94細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Caski細(xì)胞、ME-180細(xì)胞和SiHa細(xì)胞均購(gòu)買(mǎi)于蓋寧生物。

1.1.2 藥物與試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Sigma公司；CCK-8試劑盒購(gòu)買(mǎi)于MCE公司；Transwell板購(gòu)于康寧公司；基質(zhì)膠購(gòu)于BD公司；pcDNA3.1和pcDNA3.1-MEI1(過(guò)表達(dá)MEI1)、psPAX2和pMD2G(表達(dá)載體包裝體系所含片段)、pLKO.1-NO和pLKO.1-shMEI1(敲減MEI1)質(zhì)粒均購(gòu)于生物風(fēng)有限公司；MEI1引物、GAPDH引物、PCNA引物、Cyclin D1引物、E-cadherin引物、N-cadherin引物、Vimentin引物、MMP2引物、MMP-9引物、MMP-14引物均購(gòu)于武漢奧科生物有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)以及Universal SYBR? qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；一抗GAPDH(10494-1-AP)、MEI1(13456-1-AP)、PCNA(10205-2-AP)、CyclinD1(60186-1-Ig)、E-cadherin(20874-1-AP)，N-cadherin(22018-1-AP)、Vimentin(10366-1-AP)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗均購(gòu)于三鷹生物科技有限公司；Western blot試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.3 臨床標(biāo)本 本實(shí)驗(yàn)中所有組織標(biāo)本均來(lái)源于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科診斷為原發(fā)性宮頸癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本，排除合并其他惡性腫瘤、新輔助化療及伴有心、肝、腎等重大疾病患者。本研究經(jīng)過(guò)協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基于生物信息學(xué)分析MEI1在宮頸癌組織的表達(dá)及其對(duì)患者生存期的影響 在GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)中分析MEI1在宮頸癌及正常組織的表達(dá)差異。選定宮頸癌(CESC)，設(shè)定閾值log2FC=1，P<0.01，納入數(shù)據(jù)庫(kù)中正常宮頸組織與宮頸癌組織數(shù)據(jù)即可得到基因表達(dá)箱線圖；將GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析所得宮頸癌MEI1表達(dá)量中位數(shù)值定為MEI1高/低表達(dá)閥值，以月數(shù)為橫坐標(biāo)、生存率為縱坐標(biāo)繪制出生存曲線圖。

1.2.2 細(xì)胞系以及培養(yǎng)方法 將宮頸癌細(xì)胞系C-33A細(xì)胞，HCC-94細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Caski細(xì)胞、ME-180細(xì)胞和SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM中，且均在飽和濕度以及含5% CO2和37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 病毒包裝 胰酶消化、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞，于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至60%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照病毒包裝以及轉(zhuǎn)染試劑要求，plKO.1-NO/pLKO.1-shMEI1∶psPAX2∶pMD2G=4∶3∶1混合后，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，4 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)液，48 h收集細(xì)胞上清用于感染宮頸癌細(xì)胞。

1.2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)及敲減細(xì)胞系構(gòu)建 胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC94和ME-180細(xì)胞，按要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，采用嘌呤霉素(2 mg/L)持續(xù)篩選，2周后以qRT-PCR以及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)MEI1、GAPDH、PCNA、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9、MMP-14基因的mRNA表達(dá)水平。采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 5 s，70 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫組化檢測(cè) 所有入選患者的宮頸癌組織來(lái)源于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，診斷為原發(fā)性宮頸癌。取手術(shù)切除的組織進(jìn)行石蠟包埋，制備組織切片，以SP兩步法進(jìn)行免疫組化染色,以磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)作為陰性對(duì)照。加入兔抗人MEI1多克隆抗體(稀釋度1∶20，Abcam公司，ab198184)，4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)PBS清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，以PBS清洗后加入DAB顯色液，避光室溫孵育2～3 min。MEI1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色，與陰性對(duì)照一樣未著色判定為陰性。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 取處理后的細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰浴30 min，待細(xì)胞充分裂解后，4℃ 1.2×105r/min，離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳1.5 h，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜1.5 h，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，一抗MEI1以1∶2000配制，PCNA以1∶2000配制，Cyclin D1以1∶3000配制，E-cadherin以1∶2000配制，N-cadherin以1∶2000配制，Vimentin以1∶2000配制，GAPDH以1∶5000配制，4℃孵育過(guò)夜，TBST溶液洗3次，每次5 min，二抗以1∶4000稀釋配制，室溫孵育1 h，TBST溶液洗3次，每次5 min，曝光顯影。

1.2.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 取分組處理后的細(xì)胞，接種于96孔板，每孔接種2.0×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔。分別于相應(yīng)的時(shí)間避光加入CCK-8溶液50 μL；孵育4 h后，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，據(jù)此評(píng)估細(xì)胞活力。

1.2.9 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取處理后的細(xì)胞，接種于6孔板，每孔500個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。培養(yǎng)2周后用4%多聚甲醛固定10 min，1%結(jié)晶紫染色1 h，用Image J軟件計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞克隆數(shù)，取平均值。

1.2.10 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將處理后的細(xì)胞接種于12孔板，每孔接種10.0×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，24 h后用200 μL槍頭畫(huà)直線，用PBS洗3遍洗去劃掉的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算實(shí)驗(yàn)前后劃痕寬度比。

1.2.11 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移、侵襲能力 取處理后的細(xì)胞，每個(gè)加入或者不加基質(zhì)膠的Transwell小室加入無(wú)血清培養(yǎng)的10.0×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)2個(gè)平行復(fù)孔，下室加入500 μL 10%FBS-DMEM，12 h后以1%結(jié)晶紫染色，100倍鏡下觀察視野中的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞遷移率=實(shí)驗(yàn)組shRNA遷移細(xì)胞數(shù)目/對(duì)照組NC遷移細(xì)胞數(shù)×100%，細(xì)胞侵襲率=實(shí)驗(yàn)組MEI1遷移細(xì)胞數(shù)目/對(duì)照組Vector遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MEI1在正常組織以及癌旁組織的表達(dá)明顯低于癌組織

在GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)中分析MEI1在宮頸癌組織以及正常組織的表達(dá)量，其結(jié)果提示腫瘤組織中MEI1的表達(dá)量明顯高于鄰近正常組織(圖1A)。使用免疫組化檢測(cè)宮頸癌組織以及正常組織的MEI1表達(dá)量，結(jié)果顯示MEI1在腫瘤組織表達(dá)量明顯高于正常組織(圖1B)。qRT-PCR檢測(cè)10例我院婦產(chǎn)科宮頸癌患者的腫瘤組織以及癌旁組織，結(jié)果(圖1C)顯示腫瘤組織中MEI1的表達(dá)量明顯高于癌旁組織[(24.68±0.70)vs.(2.25±0.27)，P<0.01]。Western blot檢測(cè)4例宮頸癌組織以及配對(duì)的正常組織，結(jié)果顯示腫瘤中MEI1高表達(dá)(圖1D)，使用GEPIA分析MEI1表達(dá)量與患者總生存期的關(guān)系，提示高表達(dá)MEI1患者預(yù)后較差(圖1E)。上述結(jié)果初步提示MEI1可能參與宮頸癌的進(jìn)展。

A：GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析MEI1在宮頸癌中表達(dá)高于正常組織；B：免疫組化示MEI1在腫瘤組織表達(dá)量明顯高于正常組織；C：qRT-PCR示MEI1在宮頸癌組織中表達(dá)量明顯高于癌旁組織；D：Western blot實(shí)驗(yàn)顯示MEI1在宮頸癌組織中高表達(dá)，T為宮頸癌組織，N為正常癌旁組織；E：利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)繪制MEI1高表達(dá)及低表達(dá)患者生存曲線

2.2 MEI1在各宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

以Western blot檢測(cè)各宮頸癌細(xì)胞系中MEI1的表達(dá)量，其結(jié)果(圖2A)提示MEI1在HCC-94細(xì)胞中高表達(dá)，在ME-180細(xì)胞中低表達(dá)；以qRT-PCR進(jìn)一步確定MEI1在各細(xì)胞系中的表達(dá)量[C-33A，(4.25±0.13)；HCC-94，(14.13±0.56)；HeLa，(8.65±0.25)；CasKi，(4.98±0.33)；ME-180，(2.23±0.13)；SiHa，(8.12±0.21)]?；谝陨辖Y(jié)果，構(gòu)建轉(zhuǎn)染對(duì)照shNC的HCC-94細(xì)胞(HCC-94-shNC，對(duì)照組)，轉(zhuǎn)染shMEI1敲減MEI1的HCC-94細(xì)胞(HCC-94-shMEI1，敲減MEI1組)和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-的ME-180細(xì)胞(ME-180-vector，對(duì)照組)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MEI1過(guò)表達(dá)MEI1的ME-180細(xì)胞(ME-180-MEI1，過(guò)表達(dá)MEI1組)。使用Western blot檢測(cè)上述細(xì)胞中MEI1表達(dá)情況，證明敲減以及過(guò)表達(dá)效率(圖2B)，qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果[HCC-94-shNC，(12.24±0.23)vs.HCC-94-shMEI1，(2.26±0.12)；ME-180-vector，(2.16±0.23)vs.ME-180-MEI1，(18.56±0.45)]。

A：MEI1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)；B：在宮頸癌細(xì)胞中敲減或過(guò)表達(dá)MEI1，NC：HCC-94-shNC，shRNA：HCC-94-shMEI1，vector：ME-180-vector，MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.3 MEI1調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖

采用CCK-8檢測(cè)HCC-94-shNC、HCC-94-shMEI1、ME-180-vector、ME-180-MEI1細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果(圖3A)顯示，MEI1過(guò)表達(dá)可明顯促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞ME-180的增殖活力[(3.023±0.256)vs.(2.254±0.264)，P<0.01]，敲減MEI1則顯著抑制HCC-94細(xì)胞的增殖活力[(1.364±0.265)vs.(2.124±0.326)，P<0.01]。平板克隆實(shí)驗(yàn)(圖3B、3C)也證明MEI1過(guò)表達(dá)可增加宮頸癌細(xì)胞ME-180集落形成的數(shù)目(356±23)vs.(106±12)，P<0.01)，敲減MEI1抑制HCC-94細(xì)胞集落形成[(56±10)vs.(101±9)，P<0.01)。隨后，檢測(cè)MEI1對(duì)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和PCNA表達(dá)的影響，Western blot結(jié)果(圖3D)提示MEI1過(guò)表達(dá)可上調(diào)ME-180細(xì)胞中Cyclin D1和PCNA表達(dá)，而敲減MEI1抑制HCC-94細(xì)胞中上述兩種蛋白的表達(dá)，qRT-PCR(圖3E)也同樣證明MEI1過(guò)表達(dá)可提高M(jìn)E-180細(xì)胞中Cyclin D1和PCNA的mRNA水平[(8.56±0.78)vs.(2.23±0.25)，P<0.01；(13.26±0.89)vs.(3.45±0.21)，P<0.01]，而敲減MEI1則降低HCC-94細(xì)胞中Cyclin D1和PCNA的mRNA表達(dá)量[(2.12±0.23)vs.(7.59±0.45)，P<0.01；(3.12±0.36)vs.(8.12±0.82)，P<0.01]。上述結(jié)果證明MEI1可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，并可能是通過(guò)調(diào)控Cyclin D1和PCNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

A：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力；B，C：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)；D：Western blot檢測(cè)Cyclin D1和PCNA蛋白表達(dá)；E：qRT-PCR檢測(cè)Cyclin D1和PCNA的mRNA表達(dá)；NC：HCC-94-shNC，shRNA：HCC-94-shMEI1，vector：ME-180-vector，MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MEI1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響

利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)MEI1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響，48 h后測(cè)量細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算實(shí)驗(yàn)前后劃痕寬度比，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞HCC-94-shNC的遷移速度明顯高于MEI1敲減后的宮頸癌細(xì)胞(HCC-94-shMEI1)遷移速度[劃痕寬度比(8.26±1.63)%vs.(35.63±6.25)%，P<0.01，圖4A]；而過(guò)表達(dá)MEI1則可明顯增加宮頸癌細(xì)胞(ME-180-MEI1)的遷移能力[劃痕寬度比(15.34±3.23)%vs.(42.26±5.58)%，P<0.01，圖4B]。以上實(shí)驗(yàn)初步說(shuō)明MEI1可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移。

NC：HCC-94-shNC；shRNA：HCC-94-shMEI1；vector：ME-180-vector；MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)證明MEI1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，采用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究MEI1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。

結(jié)果顯示，與對(duì)照組(HCC-94-shNC)相比，敲減MEI1后HCC-94-shMEI1細(xì)胞的遷移明顯降低[(35±8)vs.(95±12)，P<0.01]，其侵襲能力也明顯降低[(30±7)vs.(105±21)，P<0.01]，見(jiàn)圖5A；而過(guò)表達(dá)MEI1不僅可以上調(diào)宮頸癌細(xì)胞ME-180-MEI1的遷移能力[(480±32)vs.(121±20)，P<0.01)，也可促進(jìn)其侵襲能力[(476±56)vs.(103±6)，P<0.01]，見(jiàn)圖5B。

NC：HCC-94-shNC；shRNA：HCC-94-shMEI1；vector：ME-180-vector；MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.6 MEI1調(diào)控宮頸癌細(xì)胞EMT

EMT廣泛參與多種腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)探究了MEI1對(duì)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控。結(jié)果顯示，MEI1過(guò)表達(dá)可顯著上調(diào)ME-180細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14等蛋白的表達(dá)，在HCC-94細(xì)胞中敲減MEI1后，上述蛋白的表達(dá)量明顯降低(圖6A)；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果也符合同樣的變化特征(圖6B)。此外，Western blot(圖6C)和qRT-PCR(圖6D)結(jié)果也證明MEI1過(guò)表達(dá)可顯著抑制ME-180細(xì)胞中上皮樣蛋白E-cadherin的表達(dá)，而明顯促進(jìn)其基質(zhì)樣蛋白N-cadherin和Vimentin的表達(dá)；MEI1敲減后則可上調(diào)HCC-94細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)其N(xiāo)-cadherin以及Vimentin的表達(dá)。綜上所述，MEI1可能是通過(guò)參與調(diào)控EMT進(jìn)而調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的遷移侵襲。

A：Western blot檢測(cè)金屬基質(zhì)蛋白的表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)金屬基質(zhì)蛋白mRNA表達(dá)；C：Western blot檢測(cè)cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；D：qRT-PCR檢測(cè)cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)；NC：HCC-94-shNC；shRNA：HCC-94-shMEI1；vector：ME-180-vector；MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

3 討論

DNA雙鏈斷裂的程序性啟動(dòng)是細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂同源重組的重要途徑，這對(duì)機(jī)體第一次減數(shù)分裂以及生育時(shí)染色體的分離是必不可少的[11]。MEI1是MEI蛋白家族的一員，參與上述細(xì)胞生理過(guò)程。有研究者發(fā)現(xiàn)MEI1的錯(cuò)義突變可以導(dǎo)致不孕，這可能是MEI1突變后不能正常維持細(xì)胞減數(shù)分裂的生理過(guò)程所致[12]。

有研究發(fā)現(xiàn)MEI1雙等位基因突變可引起復(fù)發(fā)性雄性單精子性葡萄胎、流產(chǎn)以及人類不育的現(xiàn)象[13]，這為人類生殖與疾病方面研究提供新思路。

EMT作為重要的生理機(jī)制，不僅可影響胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)在慢性炎癥以及腫瘤轉(zhuǎn)移等多方面發(fā)揮重要的作用[14]。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，一般通過(guò)抑制上皮樣分子的表達(dá)，從而使細(xì)胞與基質(zhì)或者細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附以及緊密連接減弱或者消失，使細(xì)胞獲得遷移的潛能[15-16]。細(xì)胞在經(jīng)歷EMT時(shí)除了發(fā)生上述改變，也會(huì)表達(dá)基質(zhì)樣蛋白促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)以及遷移行為的改變，比如Vimentin、N-cadherin、fibronectin等關(guān)鍵基質(zhì)樣基因的表達(dá)[16-18]。EMT在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌復(fù)發(fā)或死亡的重要危險(xiǎn)因素，EMT可引起宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是預(yù)測(cè)早期宮頸癌患者總生存期和無(wú)病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。多項(xiàng)研究表明，宮頸癌中EMT的發(fā)生增加了癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells，CSC)亞群，從而增加了宮頸癌的轉(zhuǎn)移潛能。EMT可導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞耐藥和耐輻射，抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT可增加其對(duì)輻射和藥物敏感，這種致敏作用可以提高宮頸癌患者的生存率[10]。

目前關(guān)于MEI1在腫瘤中作用的研究甚少，有文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)于HPV陰性的宮頸癌組織，MEI1在HPV感染的宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，這提示我們MEI1可能參與HPV陽(yáng)性宮頸癌的疾病進(jìn)程[4]。目前尚未有關(guān)于MEI1與EMT相關(guān)作用機(jī)制的研究報(bào)道，我們的研究發(fā)現(xiàn)MEI1在宮頸癌組織的表達(dá)量明顯高于鄰近正常組織，首次證明MEI1可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移、侵襲能力，并在機(jī)制上首次提出MEI1可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1以及PCNA促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，并可能通過(guò)激活EMT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這將為宮頸癌的治療提供新的靶點(diǎn)及治療策略。