IL-32α 通過調(diào)控miR-216b-5p/AKR1B10 軸抑制食管癌KYSE450 細胞的增殖、遷移和侵襲

吳光鋒，范瑞

（南陽市第一人民醫(yī)院，河南 南陽 473000）

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,中晚期患者5 年生存率低于10%[1]。依據(jù)組織形態(tài)學的不同，可將食管癌分為食管腺癌和食管鱗狀細胞癌，其中食管鱗狀細胞癌約占食管癌的90%[2]。腫瘤周圍浸潤的免疫細胞和其分泌的大量炎性因子可促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,抑制機體對腫瘤細胞的免疫識別[3,4]。研究顯示，多種炎癥介質(zhì)參與食管癌的發(fā)展進程[5,6]。IL-32 是一種促炎細胞因子，包含IL-32α、IL-32β、IL-32γ 等 6 種亞型, 其中 IL-32α 是最主要的亞型[7]。IL-32 的不同亞型在腫瘤、自身免疫疾病、炎癥性腸病等疾病中發(fā)揮不同作用，參與細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等過程[8,9]。一定劑量范圍的IL-32α 可能通過抑制Jak2/ STAT3 信號通路抑制胰腺癌Panc-1 和AsPC-1 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。IL-32α 通過促進 TNFR1 的信號傳導來抑制結(jié)腸癌的發(fā)展[11]。但目前，IL-32α 對食管癌細胞生物學行為的影響和機制還未知。

微小 RNA （microRNA，miRNA） 是長度約為18～25 個核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA,參與調(diào)控細胞生物學行為,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。研究顯示，miR-216b-5p 過表達可抑制胰腺癌細胞增殖，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡，并抑制體內(nèi)腫瘤發(fā)生[13]；miR-216b-5p 表達的上調(diào)可抑制宮頸癌細胞的增殖，并促進其凋亡[14]。但目前，miR-216b-5p 對食管癌細胞生物學行為的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，AKR1B10 可能是miR-216b-5p 的靶基因。AKR1B10 是細胞質(zhì)內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴的可溶性單體氧化還原酶，屬醛酮還原酶超家族成員。研究顯示，AKR1B10 參與口腔鱗狀細胞癌[15]、肺腺癌[16]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可作為腫瘤治療的潛在分子靶點。因此，本研究以食管癌KYSE450 細胞為研究對象，主要探討了 IL-32α 對 KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并以miR-216b-5p/AKR1B10 軸為切入點，探究了 IL-32α 影響 KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 食管癌細胞株KYSE450 細胞，上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；胎牛血清，杭州四季青公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；鼠抗人醛酮還原酶家族1B10（AKR1B10）單克隆抗體，美國 Abcam 公司；鼠抗人 P21、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 單克隆抗體，美國 Santa Cruz 公司；LipofectamineTM 2000 試劑盒和 Trizol 試劑，美國Invitrogen 公司； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒，大連寶生物工程公司；miR-216b-5p 模擬物（mimics）及模擬對照序列（miR-NC）、miR-216b-5p 抑制劑（anti-miR-216b-5p）及抑制劑陰性對照序列（antimiR-NC）、AKR1B10 小干擾 RNA（si-AKR1B10）及亂序無意義核苷酸序列（si-NC），上海GenePhama公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 KYSE450 細胞復蘇后，培養(yǎng)于含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 2～3d 更換一次新鮮的培養(yǎng)基。待細胞融合至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，按照1:3 的比例傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的KYSE450 細胞以每孔1×105個接種于6 孔板中，待細胞融合至60 %時，更換不含F(xiàn)BS的 RPMI 1640 培養(yǎng)基。參照 LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別將miR-216b-5p mimics、miRNC、si -AKR1B10、si -NC、anti -miR -216b -5p 和anti-miR-NC 轉(zhuǎn)染至 KYSE450 細胞。轉(zhuǎn)染 6h 后，更換含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組處理 未轉(zhuǎn)染的KYSE450 細胞分為對照組和IL-32α 組。對照組細胞正常培養(yǎng)24h,不做任何處理；IL-32α 組： 分別含 IL-32α 終濃度為 10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml[10]的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h。轉(zhuǎn)染 miR-216b-5p mimics、miR-NC、si-AKR1B10、si-NC 的細胞正常培養(yǎng)24h, 并分別記為miR-216b-5p 組、miR-NC 組、si-AKR1B10 組和 si-NC組。轉(zhuǎn)染 anti-miR-216b-5p、anti-miR-NC 的細胞用 IL-32α 終濃度為 50μg/ml 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h,分別記為 IL-32α+anti-miR-216b-5p 組和 IL-32α+anti-miR-NC 組。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖[17]未轉(zhuǎn)染的KYSE450細胞和轉(zhuǎn)染后的細胞均以每孔0.5×104個細胞接種于96 孔板中。按照1.2.2 分組處理，每組設(shè)置3個復孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μl 濃度為5mg/ml 的 MTT 溶液，繼續(xù)孵育 4h 后，吸棄上清液，加入150μl DMSO 溶解結(jié)晶紫，充分混勻，于490 nm處在酶聯(lián)免疫分析儀上測定吸光度值。

1.2.4 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲[17]未轉(zhuǎn)染的KYSE450 細胞和轉(zhuǎn)染后的細胞均用不含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整濃度為 2.5×105個/ml 的細胞懸液。遷移實驗： 取100μl 細胞懸液加入Transwell 上室，下室加入500μl 含10 %胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell 小室，吸棄培養(yǎng)基，棉簽擦去上層未遷移細胞，生理鹽水清洗。經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，顯微鏡觀察。隨機選取5 個視野對細胞計數(shù)。侵襲實驗： 將Matrigel 基質(zhì)膠與RPMI 1640 培養(yǎng)基以1:8比例稀釋，鋪于Transwell 上室。自然晾干后，加100μl 細胞懸液，剩余操作同遷移實驗。

1.2.5 qRT-PCR 檢測 miR-216b-5p 和 AKR1B10 mRNA 水平[18]Trizol 試劑提取細胞中總RNA,微量核酸儀檢測RNA 純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增。引物序列：miR-216b-5p 上游5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'，下游5'-GGGGAAATCTCTGCAGGCAA-3'；U6 上 游 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3'，下游 5'-GT GCTCG CTTCGGCAGC-3'；AKR1B10 上 游 5'-CCCAAAGATGATAAAGGTAATGCCATCGGT-3'，下游 5'-C GATCTGGAAGTGGCTGAAATTGGAGA-3' ；GAPD H 上游 5'-ATGACCCCTTCATTGA CC-3'，下游 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR 擴增條件：95℃預變性 5mins，95℃變性 10s，60℃退火 1min，72℃延伸 30s，共計 35 個循環(huán)。miR-216b-5p 以 U6為內(nèi)參，AKR1B10 以 GAPDH 為內(nèi)參, 采用 2－△△Ct法計算miR-216b-5p 和AKR1B10 mRNA 的相對表達水平。

1.2.6 Western Blot 法 檢 測 AKR1B10、CyclinD1、p21、MMP-2 和 MMP-9 蛋白水平[19]RIPA 試劑提取細胞中總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。分別取30μl 蛋白溶液，沸水中煮沸 5min，行 SDS-PAGE電泳。電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，置于5%脫脂奶粉溶液中孵育 1h。TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。加入一抗，4℃孵育過夜。TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min。然后加入化學發(fā)光試劑避光顯影，應(yīng)用Quantity One 軟件進行圖像分析。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀃12]經(jīng)TargetScan在線軟線預測顯示，AKR1B10 的 3’UTR 中含有miR-216b-5p 的結(jié)合位點。PCR 擴增含有miR-216b-5p 結(jié)合位點的 AKR1B10 的 3’UTR，將擴增后的片段插入PGEM-T easy 載體，構(gòu)建AKR1B10的3’UTR 野生型質(zhì)粒。利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點突變后,插入PGEM-T easy 載體,構(gòu)建 AKR1 B10 的 3’UTR 突變型質(zhì)粒。分別將 AKR1B10 的3’UTR 野生型、突變型質(zhì)粒與miR-216b-5p mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的 KYSE450 細胞，轉(zhuǎn)染后6h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒，測定細胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析 利用SPSS.22.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示。兩組間比較用獨立樣本t 檢驗；多組間比較用單因素方差分析,進一步兩組間比較采用LSD-t 分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-32α 對 KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組比較，IL-32α 組 KYSE450 細胞抑制率顯著升高（P＜0.05），遷移和侵襲細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）,CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白水平顯著降低(P＜0.05),p21 蛋白水平顯著升高(P＜0.05),且呈劑量依賴性。見圖1、圖2 和表1。

圖1 IL-32α 對 KYSE450 細胞中 CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達的影響

表1 IL-32α 對KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響（±s，n=9）

表1 IL-32α 對KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響（±s，n=9）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 IL-32α 10μg/ml 組比較，bP＜0.05；與依托咪酯 IL-32α 25μg/ml 組比較，cP＜0.05

分組對照組IL-32α 10μg/ml 組IL-32α 25μg/ml 組IL-32α 50μg/ml 組F P抑制率（%）0.00±0.00 10.65±1.14a 27.45±2.31ab 44.29±4.38abc 525.870 0.000遷移細胞數(shù)（個）侵襲細胞數(shù)（個） CyclinD1 蛋白 p21 蛋白 MMP-2 蛋白 MMP-9 蛋白105.69±10.36 79.28±7.35a 59.36±5.28ab 41.02±4.57abc 131.687 0.000 89.35±8.04 63.21±6.87a 42.28±4.35ab 28.64±3.98abc 171.972 0.000 0.76±0.07 0.65±0.06a 0.52±0.05ab 0.38±0.03abc 81.555 0.000 0.25±0.03 0.39±0.04a 0.53±0.05ab 0.66±0.06abc 130.988 0.000 0.79±0.07 0.68±0.06a 0.55±0.05ab 0.36±0.03abc 103.361 0.000 0.68±0.06 0.53±0.05a 0.41±0.04ab 0.25±0.03abc 139.081 0.000

2.2 IL-32α 對 KYSE450 細 胞 miR-216b-5p 和AKR1B10 表達的影響 與對照組比較，IL-32α 組miR-216b-5p 水平顯著升高 （P＜0.05），AKR1B10 mRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖3 和表2。

2.3 miR-216b-5p 靶向調(diào)控AKR1B10 的表達 生物信息學軟件預測顯示，AKR1B10 的3’UTR 中含有與miR-216b-5p 互補的核苷酸序列，見圖4A。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-216b-5p 組WT-AKR1B10 的熒光素酶活性顯著低于miR-NC組 （P＜0.05），miR-216b-5p 組 MUT-AKR1B10 的熒光素酶活性與miR-NC 組比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,見表3。與 miR-NC 組比，miR-216b-5p組 AKR1B10 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與 antimiR-NC 組比，anti-miR-216b-5p 組 AKR1B10 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖4B 和表4。

圖2 IL-32α 對KYSE450 細胞遷移和侵襲的影響

圖3 IL-32α 對KYSE450 細胞中AKR1B10 蛋白表達的影響

表2 IL-32α 對KYSE450 細胞miR-216b-5p和 AKR1B10 表達的影響（±s，n=9）

表2 IL-32α 對KYSE450 細胞miR-216b-5p和 AKR1B10 表達的影響（±s，n=9）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 IL-32α 10μg/ml 組比較，bP＜0.05；與IL-32α 25μg/ml 組比較，cP＜0.05

分組 miR-216b-5p AKR1B10 蛋白對照組IL-32α 10μg/ml 組IL-32α 25μg/ml 組IL-32α 50μg/ml 組F P 1.00±0.08 1.75±0.18a 2.04±0.21ab 2.81±0.25abc 138.669 0.000 AKR1B10 mRNA 1.02±0.08 0.79±0.07a 0.65±0.06ab 0.43±0.04abc 133.727 0.000 0.69±0.06 0.50±0.05a 0.39±0.03ab 0.26±0.03abc 150.987 0.000

圖4 miR-216b-5p靶向調(diào)控AKR1B10 的表達

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05

分組 WT-AKR1B10 miR-NC miR-216b-5p t P 1.00±0.09 0.37±0.03a 19.922 0.000 MUT-AKR1B10 0.98±0.08 1.01±0.09 0.747 0.466

表4 miR-216b-5p對 AKR1B10 蛋白表達的影響（±s，n=9）

表4 miR-216b-5p對 AKR1B10 蛋白表達的影響（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05；與 anti-miR-NC 組比較，bP＜0.05

分組 AKR1B10 蛋白miR-NC miR-216b-5p anti-miR-NC anti-miR-216b-5p F P 0.63±0.06 0.27±0.03a 0.51±0.06 0.96±0.09b 183.167 0.000

2.4 miR-216b-5p 過表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響 與miR-NC 組比較，miR-216b-5p 組 miR-216b-5p 水平顯著升高（P＜0.05）,表明miR-216b-5p mimics 轉(zhuǎn)染成功,KYSE450 細胞中miR-216b-5p 過表達。與 miR-NC 組比較，miR-216b-5p 組KYSE450 細胞抑制率顯著升高 (P＜0.05), 遷移和侵襲細胞數(shù)顯著降低 (P＜0.05),CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白水平顯著降低 (P＜0.05),p21 蛋白水平顯著升高(P＜0.05)。見圖5 和表5。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-216b-5pmimics后KYSE450細胞中CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達

2.5 抑制AKR1B10 表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響 與si-NC 組比較，si-AKR1B10 組AKR1B10 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）,表明 KYS E450 細胞中 AKR1B10 表達抑制。與 si-NC 組比較，si-AKR1B10 組KYSE450 細胞抑制率顯著升高（P＜0.05）,遷移和侵襲細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）,CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），p21 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。見圖6和表6。

2.6 抑制 miR-216b-5p 表達逆轉(zhuǎn)了 IL-32α（50μg/ml） 對 KYSE450 細胞增殖、 遷移侵襲的作用 與IL-32α+anti-miR-NC 組比較，IL-32α+anti-miR-216b-5p 組 KYSE450、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平和遷移、侵襲細胞數(shù)顯著升高（P＜0.05），KYSE450 細胞抑制率和p21 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。見圖7 和表7。

表5 miR-216b-5p過表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響（±s，n=9）

表5 miR-216b-5p過表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05

分組 miR-216b-5p 抑制率（%） 遷移細胞數(shù)（個）侵襲細胞數(shù)（個）CyclinD1 蛋白miR-NC miR-216b-5p t P 1.00±0.09 2.78±0.28a 18.157 0.000 5.39±0.55 33.58±3.36a 24.839 0.000 101.25±9.28 59.67±5.82a 11.388 0.000 92.45±8.67 39.54±3.71a 16.832 0.000 0.77±0.07 0.35±0.03a 16.545 0.000 p21 蛋白0.23±0.03 0.59±0.05a 18.522 0.000 MMP-2 蛋白0.78±0.07 0.39±0.04a 14.512 0.000 MMP-9 蛋白0.69±0.07 0.31±0.03a 14.969 0.000

圖6 轉(zhuǎn)染 si-AKR1B10 后 KYSE450 細胞中AKR1B10、CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達

圖7 IL-32α 對轉(zhuǎn)染anti-miR-216b-5p的AKR1B10 中AKR1B10、CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達的影響

表6 抑制AKR1B10 對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響（±s，n=9）

表6 抑制AKR1B10 對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05

分組 AKR1B10 蛋白 抑制率（%） 遷移細胞數(shù)（個）侵襲細胞數(shù)（個）CyclinD1 蛋白si-NC si-AKR1B10 t P 0.66±0.06 0.25±0.03a 18.336 0.000 6.87±0.61 30.59±3.28a 21.329 0.000 96.38±9.05 57.36±5.47a 11.070 0.000 87.62±8.39 42.61±4.38a 14.267 0.000 0.75±0.07 0.33±0.03a 16.545 0.000 p21 蛋白0.22±0.03 0.61±0.05a 20.065 0.000 MMP-2 蛋白 MMP-9 蛋白0.77±0.07 0.41±0.04a 13.396 0.000 0.71±0.07 0.29±0.03a 16.545 0.000

表7 抑制miR-216b-5p逆轉(zhuǎn)了IL-32α（50μg/ml）對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的作用（±s，n=9）

表7 抑制miR-216b-5p逆轉(zhuǎn)了IL-32α（50μg/ml）對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的作用（±s，n=9）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 IL-32α+anti-miR-NC 組比較，bP＜0.05

分組 miR-216b-5 p AKR1B10蛋白抑制率（%）遷移細胞數(shù)（個）對照組IL-32α 組IL-32α+anti-miR-NC IL-32α+anti-miR-216b-5p 1.03±0.09 2.79±0.27a 2.83±0.26 1.67±0.17b 0.68±0.06 0.26±0.03a 0.24±0.03 0.57±0.05b 0.00±0.00 43.69±4.38a 44.08±4.87 16.85±1.74b 105.84±9.35 43.58±4.32a 40.29±4.87 79.65±7.04b侵襲細胞數(shù)（個）p21 蛋白 MMP-2 蛋白MMP-9 蛋白88.65±8.37 33.65±3.87 32.15±4.07 68.36±6.27b CyclinD1 蛋白0.74±0.07 0.36±0.03a 0.34±0.03 0.62±0.06b 0.24±0.03 0.65±0.06a 0.67±0.07 0.36±0.03b 0.81±0.07 0.38±0.04a 0.35±0.03 0.69±0.06b 0.67±0.06 0.29±0.03a 0.27±0.03 0.58±0.05b F P 158.008 0.000 223.101 0.000 182.654 0.000 196.028 0.000 194.742 0.000 135.495 0.000 159.612 0.000 170.046 0.000 187.253 0.000

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食管癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展與腫瘤微環(huán)境關(guān)系密切[20]。炎癥在組織周圍釋放的大量炎性因子參與腫瘤的生長[21]。腫瘤微環(huán)境中的多種炎性介質(zhì)已用于腫瘤治療的藥物靶點,在腫瘤治療的臨床試驗中取得了一定的治療效果[22]。IL-32 是一種內(nèi)源性的炎癥調(diào)控因子，可誘導IL-6、IL-8 等炎性介質(zhì)的表達，在炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。IL-32α 是 IL-32 的主要亞型，研究顯示,外源性的IL-32α 可抑制人黑素瘤HTB-72 細胞增殖，并誘導其凋亡[24]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的IL-32α 可抑制KYSE450 細胞增殖，遷移和侵襲，且呈劑量依賴性,為食管癌的靶向治療提供了一定的新思路，但其作用機制有待深入研究。

miRNA 廣泛存在于真核生物體內(nèi)，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-216b-5p 抑制了 KYSE450 細胞增殖、 遷移和侵襲，說明miR-216b-5p 參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展，上調(diào)其表達可延緩食管癌發(fā)展進程。為了探究IL-32α 抑制食管癌細胞增殖、 遷移和侵襲的作用機制,本研究檢測了IL-32α 對食管癌細胞中miR-216b-5p 水表達的影響，結(jié)果顯示，IL-32α 可促進KYSE450 細胞中miR-216b-5p 的表達，提示 IL-32α 可能通過上調(diào) miR-216b-5p 表達抑制KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA 可與其靶 mRNA 的 3’UTR 結(jié)合，抑制靶mRNA 翻譯或降解靶mRNA,通過調(diào)控靶基因表達發(fā)揮生物學作用。在線靶基因預測軟件預測顯示,AKR1B10 可能是miR-216b-5p 的靶基因。本研究利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-216b-5p 可與 AKR1B10 的 3’UTR 靶向結(jié)合。同時,上調(diào)miR-216b-5p 表達抑制了AKR1B10 蛋白的表達, 而下調(diào)miR-216b-5p 表達促進了AKR1 B10 蛋白的表達,進一步說明了miR-216b-5p 靶向負調(diào)控AKR1B10 表達。AKR1B10 參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展, 如沉默AKR1B10 表達可能通過FAK/Src/Rac1 信號通路抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲[25]，miR-383-5p 通過靶向調(diào)控 AKR1B10 表達阻滯肝癌細胞的細胞周期進程，抑制細胞生長[26]。本研究結(jié)果顯示，抑制AKR1B10 表達抑制了食管癌KYSE450 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與相關(guān)研究報道結(jié)果一致[27]。研究還顯示，IL-32α 可抑制KYSE450 細胞中AKR1B10 的表達，而抑制miR-216b-5p 表達逆轉(zhuǎn)了 IL-32α 對食管癌 KYSE450細胞增殖、遷移和侵襲的影響，提示IL-32α 可能通過上調(diào)KYSE450 細胞中miR-216b-5p 表達，進而靶向負調(diào)控AKR1B10 表達抑制KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，IL-32α 是一種可抑制食管癌細胞KYSE450 的增殖、遷移和侵襲的炎性細胞因子，其可能通過調(diào)控細胞中miR-216b-5p/AKR1B10 軸發(fā)揮作用。