超高效液相色譜-波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定健脾丸（濃縮丸）中4種成分的含量

鄭 昆，倫志彩，羅兆亮

（1.日照市中醫(yī)醫(yī)院，山東 日照 276800；2.莒縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 莒縣 276599；3.臨沂萊博醫(yī)藥技術(shù)有限公司，山東 臨沂 276017）

健脾丸（濃縮丸）是由黨參、炒白術(shù)、陳皮、枳實(shí)（炒）、炒山楂和炒麥芽六味中藥組成的中藥制劑，其功能主治為健脾開胃，用于脾胃虛弱，脘腹脹滿，食少便溏[1]。其中黨參具有健脾益肺，養(yǎng)血生津作用[2]；炒白術(shù)具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎作用[2]。陳皮和枳實(shí)具有理氣健脾，破氣消積，化痰散痞作用。健脾丸是臨床常用的中藥制劑，其濃縮丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊(cè)。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，均以陳皮和枳實(shí)中共同存在的橙皮苷和柚皮苷等指標(biāo)成分的含量測(cè)定對(duì)健脾丸進(jìn)行質(zhì)量控制[5-8]。目前，現(xiàn)有文獻(xiàn)中缺少對(duì)處方中黨參和白術(shù)的質(zhì)量控制方法。超高效液相色譜技術(shù)（UPLC）與傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）相比，具有分析速度快、靈敏度高、節(jié)約流動(dòng)相等優(yōu)點(diǎn)[9-11]，尤其是對(duì)多組分樣品進(jìn)行分析時(shí)，可顯著提高分析效率。本文以黨參和白術(shù)中4種特有成分黨參炔苷（黨參）、白術(shù)內(nèi)酯I、II、III（白術(shù)）作為指標(biāo)成分，采用UPLC技術(shù)，建立含量測(cè)定分析方法，對(duì)健脾丸中的黨參和白術(shù)進(jìn)行質(zhì)量分析，從而控制健脾丸的質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1290型超高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（美國(guó)Agilent公司）；Meteler XP205型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-600DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；A10型超純水機(jī)[密理博（中國(guó)）有限公司]。

1.2 試藥

黨參炔苷對(duì)照品（批號(hào)：111732-201908，純度100 %），白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)照品（批號(hào)：111975-201501，純度99.9 %），白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)照品（批號(hào)：111976-201501，純度99.9 %），白術(shù)內(nèi)酯III對(duì)照品（批號(hào)：111978-201501，純度99.9 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；健脾丸（規(guī)格：濃縮丸，每8丸相當(dāng)于原生藥3 g，批號(hào)：191104，19110202，191004，仲景宛西制藥股份有限公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸（色譜純），超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Poroshell 120 SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流速為0.5 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm（0～13.5 min，檢測(cè)黨參炔苷和白術(shù)內(nèi)酯III）和220 nm（13.5～25 min，檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯II）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μl；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1 %乙酸（B），梯度洗脫：0～9 min，20 %A～50 %A；9～16 min，50 %A～55 %A；16～25 min，55 %A～100 %A。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取本品，研碎，精密稱取約2.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流提取1 h，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取黨參炔苷照品101.57 mg，白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)照品16.43 mg，白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)照品10.67 mg，白術(shù)內(nèi)酯III對(duì)照品18.61 mg，分別置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊(cè)中收載健脾丸（濃縮丸）的處方制法，分別制備不含黨參與不含白術(shù)的陰性樣品，然后按供試品溶液的制備方法，分別制備缺少黨參陰性樣品溶液和缺少白術(shù)陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺黨參陰性樣品溶液與缺白術(shù)陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果各成分色譜峰峰形對(duì)稱，分離度良好。在缺少黨參陰性樣品溶液和缺少白術(shù)陰性樣品溶液色譜圖中4種待測(cè)成分相應(yīng)保留時(shí)間處沒有其他色譜峰，說(shuō)明不存在其他成分的干擾。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 ml，分別置100 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得各對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各對(duì)照品溶液的濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)（r）結(jié)果見表1。

表1 4種待測(cè)成分回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，記錄4種待測(cè)成分峰面積的RSD分別為1.17 %，1.04 %，1.28 %和1.05 %，表明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：191104），按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，記錄4種待測(cè)成分色譜峰面積。結(jié)果4種成分峰面積的RSD分別為1.33 %，1.42 %，1.26 %，1.34 %，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：191104），按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分色譜峰面積并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其含量。結(jié)果，4種成分含量的RSD（n=6）分別為1.52 %，1.35 %，1.67 %，1.82 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：191104），精密稱取1.0 g，共6份，置錐形瓶中，分別精密加入4種待測(cè)成分對(duì)照品貯備溶液各0.5 ml，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算4種待測(cè)成分的回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 耐用性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下供試品溶液，分別改變高效液相色譜儀（Agilent 1290和LC20A）、色譜柱型號(hào)[Poroshell 120 SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Accucore C18（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）]、柱溫（30 ℃、40 ℃和室溫）和流速（0.45，0.5，0.55 ml/min）等條件，考察其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在上述范圍內(nèi)改變色譜條件，各色譜峰的分離度良好，表明本方法的耐用性良好。

2.10 樣品測(cè)定

取健脾丸3批，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。不同批次產(chǎn)品的含量基本一致，說(shuō)明本藥在不同批次間的質(zhì)量較為穩(wěn)定。

表3 含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)比較了分別以甲醇-水與乙腈-水作為流動(dòng)相的洗脫效果。選擇甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，黨參炔苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度較差，且白術(shù)內(nèi)酯III色譜峰峰形較差，色譜系統(tǒng)的壓力較高，對(duì)色譜柱不利。選擇乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，色譜系統(tǒng)壓力較低，有利于保護(hù)色譜柱，黨參炔苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度較好，為了改善色譜峰的峰形，在水中加入0.1 %乙酸，此時(shí)各待測(cè)成分色譜峰峰形對(duì)稱，因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-0.1 %乙酸溶液作為流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，掃描4種待測(cè)成分的紫外吸收曲線（見圖2），發(fā)現(xiàn)黨參炔苷和白術(shù)內(nèi)酯III在270 nm波長(zhǎng)處具有較強(qiáng)紫外吸收，白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯II在220 nm波長(zhǎng)處具有較強(qiáng)紫外吸收，為了提高各成分的響應(yīng)值，提高檢測(cè)靈敏度，本文采用檢測(cè)波長(zhǎng)切換法，分別選擇270 nm（0～13.5 min，檢測(cè)黨參炔苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ）和220 nm（13.5～25 min，檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯II）作為4種待測(cè)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 不同檢測(cè)波長(zhǎng)HPLC圖譜

健脾丸（濃縮丸）是《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中收載的中成藥制劑，該藥在臨床使用中用量較大，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和已發(fā)表的文獻(xiàn)僅對(duì)組方中陳皮和枳實(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制，缺少對(duì)黨參和白術(shù)的質(zhì)量控制。本文采用UPLC，以黨參和白術(shù)為研究對(duì)象，對(duì)黨參和白術(shù)中4種成分進(jìn)行含量測(cè)定，可有效控制該制劑中黨參和白術(shù)的質(zhì)量。本文研究方法重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可為健脾丸（濃縮丸）質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。