妊娠期糖尿病患者血清和胎盤氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平與妊娠結(jié)局的關(guān)系

談炯新 李蕊 郭綺棱 劉懷昌 肖磊

妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus，GDM）的病率每年逐漸上升［1］。GDM 和分娩相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］。預(yù)防和及早干預(yù)GDM 是目前臨床的重要方向，但GDM 其具體的發(fā)生機(jī)制仍未明確。研究表明，氧化應(yīng)激在GDM的發(fā)生中起著重要作用［4］。國外研究表明，患有GDM 的孕婦表現(xiàn)出高血糖誘導(dǎo)的循環(huán)氧化應(yīng)激增加和抗氧化酶的減少［5］。胎盤是胎兒與母體之間物質(zhì)交換的重要器官，孕婦處于糖尿病或高葡萄糖狀態(tài)下時(shí)，胎盤中的氧化應(yīng)激反應(yīng)會有所增強(qiáng)，有研究指出胎盤應(yīng)對母體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)具有保護(hù)作用。進(jìn)一步研究［6］發(fā)現(xiàn)，NOS2 啟動子中功能性多態(tài)性rs2779249 位點(diǎn)的變異基因型是反復(fù)妊娠流產(chǎn)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此，胎盤氧化應(yīng)激機(jī)制與妊娠結(jié)局密切相關(guān)。但目前對于GDM 患者中胎盤的氧化應(yīng)激指標(biāo)與妊娠結(jié)局的關(guān)系仍未明確少見報(bào)道。因此，本研究旨在探討GDM 患者胎盤和血清中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的變化，并評估這些標(biāo)志物與GDM 患者妊娠結(jié)局之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2017年8月至2019年6月于本院產(chǎn)科門診接受孕期檢查診斷為GDM 的孕婦共108 例作為GDM 組，選取同期的健康孕婦90 例作為對照組；本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核通過。記錄所有孕婦的一般資料，包括年齡、體重指數(shù)、孕周、妊娠結(jié)局，包括剖腹產(chǎn)、巨大兒、胎膜早破、早產(chǎn)的比例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合妊娠期糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：根據(jù)妊娠24～28 周口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）的結(jié)果診斷為GDM。②年齡為18～40歲；③經(jīng)患者知情同意并簽署同意書。④所有孕婦獲得隨訪；排除妊娠期高血壓、先兆子癇、甲狀腺機(jī)能減退和前置胎盤的孕婦。

1.2 標(biāo)本收集

在孕婦32 周和分娩前血糖穩(wěn)定后，收集靜脈血，經(jīng)離心后取血清在-80℃下冰箱中保存，直至進(jìn)一步處理。然后跟蹤所有患者的妊娠結(jié)局。然后通過收集所有孕婦產(chǎn)后的胎盤組織，用于通過免疫組織化學(xué)測定觀察胎盤中氧化應(yīng)激表達(dá)的標(biāo)志物。

1.3 血清指標(biāo)檢測

氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）1、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）均采用ELISA 法進(jìn)行測定。其中一抗GSH（GDG8141）、SOD1（YB-E11086）和MDA（YS05455B）ELISA 檢測試劑盒均購自上海鈺博生物科技有限公司。具體檢測方法嚴(yán)格按照說明書上進(jìn)行，具體操作由本院檢驗(yàn)科醫(yī)生完成。

1.4 免疫組化檢測

孕婦分娩后15 min 內(nèi)，從胎盤組織中取大小約1×1×1 cm 的全厚胎盤組織固定在10%福爾馬林中。收集樣本時(shí)避免出現(xiàn)邊緣、鈣化、出血和壞死的區(qū)域。將組織進(jìn)行石蠟包埋，切成5 μm 進(jìn)行制片作免疫組織化學(xué)染色。免疫組化計(jì)算方法［6］：染色強(qiáng)度分級為0 至3 級，0 為未染色，1 為棕黃色，2 為黃色，3 為棕色。染色程度評分如下：0分、1 分、2 分、3 分［7］。將染色強(qiáng)度和程度相乘得到總計(jì)分以確定表達(dá)強(qiáng)度：0 表示無表達(dá)，1～3 分表示弱表達(dá)，4～6 分為中等表達(dá)；7～9 為強(qiáng)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，比較采用卡方檢驗(yàn)。使用Spearman 相關(guān)分析不同指標(biāo)的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦的一般情況對比

兩組患者的平均年齡、體重、BMI 和孕周對比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 兩組孕婦的妊娠結(jié)局對比

GDM 組孕婦妊娠結(jié)局發(fā)生剖宮產(chǎn)和早產(chǎn)的比例顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組發(fā)生巨大兒和胎膜早破的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2～3。

表1 兩組孕婦的一般指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of general indicators between 2 groups of pregnant women（±s）

表1 兩組孕婦的一般指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of general indicators between 2 groups of pregnant women（±s）

組別GDM 組對照組t 值P 值n 108 90 SOD1 5.4±0.9 6.7±0.7 11.172＜0.001 HO-1 7.3±1.2 4.9±2.1 10.070＜0.001 NQO1 6.4±1.3 4.6±1.1 10.395＜0.001 Nrf2 5.3±0.9 3.5±1.0 13.321＜0.001

表2 兩組孕婦的妊娠結(jié)局比較（±s）Table 2 Comparison of pregnancy outcomes between 2 groups of pregnant women（±s）

表2 兩組孕婦的妊娠結(jié)局比較（±s）Table 2 Comparison of pregnancy outcomes between 2 groups of pregnant women（±s）

組別GDM 組對照組t 值P 值n 108 90年齡（歲）30.6±2.1 30.4±2.8 0.574 0.567體重（kg）56.5±1.7 56.8±1.9 1.172 0.243 BMI（kg/m2）23.3±1.7 23.1±1.5 0.852 0.395孕周（周）37.3±0.5 37.4±0.4 1.532 0.127

表3 兩組孕婦的血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）Table 3 Comparison of serum oxidative stress indicators between 2 groups of pregnant women（±s）

表3 兩組孕婦的血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）Table 3 Comparison of serum oxidative stress indicators between 2 groups of pregnant women（±s）

組別GDM 組對照組χ2值P 值n 108 90剖宮產(chǎn)53 29 5.746 0.017巨大兒13 6 1.632 0.201胎膜早破16 9 1.032 0.310早產(chǎn)12 3 4.241 0.039

2.3 兩組孕婦胎盤組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)情況

分娩前和32 周的GSH、SOD1 和MDA 水平對比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分娩前和32 周的GDM 組孕婦的GSH 和MDA 指標(biāo)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），GDM 組孕婦的SOD1 指標(biāo)高于對照組（t=9.721，P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 兩組孕婦胎盤組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)情況（±s）Table 4 The expression of oxidative stress indicators in the placenta tissue of 2 groups of pregnant women（±s）

表4 兩組孕婦胎盤組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)情況（±s）Table 4 The expression of oxidative stress indicators in the placenta tissue of 2 groups of pregnant women（±s）

時(shí)間32 周組別GDM 組對照組n 108 90 t 值P 值分娩前GDM 組對照組108 90 t 值P 值GSH（μmol/mL）2.13±0.21 2.41±0.23 8.945＜0.001 2.21±0.33 2.45±0.35 4.957＜0.001 SOD1（U/mL）12.4±1.9 14.8±1.5 9.721＜0.001 12.8±2.6 15.3±2.9 6.392＜0.001 MDA（nmol/L）1.82±0.29 1.64±0.15 5.323＜0.001 1.85±0.26 1.70±0.29 3.835＜0.001

圖1 免疫組化圖（IHC，×200）Figure 1 Immunohistochemical diagram（IHC，×200）

2.4 血清和胎盤氧化應(yīng)激指標(biāo)的關(guān)系

GDM 組孕婦的胎盤SOD1 與血清GSH、SOD 呈正相關(guān)（P＜0.05），血清MDA 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。胎盤HO-1、NQO1 和Nrf2 的表達(dá)水平均與血清GSH、SOD 呈負(fù)相關(guān)，與血清MDA呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

表5 血清和胎盤氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of serum and placental oxidative stress indicators

2.5 胎盤氧化應(yīng)激指標(biāo)與妊娠結(jié)局的關(guān)系

剖宮產(chǎn)孕婦的胎盤組織中SOD1 表達(dá)水平低于非剖宮產(chǎn)孕婦（P＜0.05），HO-1、NQO1 和Nrf2 表達(dá)水平高于非剖宮產(chǎn)孕婦（P＜0.05）。出現(xiàn)早產(chǎn)的孕婦其胎盤組織SOD1 表達(dá)水平低于非早產(chǎn)孕婦，HO-1 高于早產(chǎn)孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 GDM 孕婦不同妊娠結(jié)局的胎盤氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）Table 6 Comparison of placental oxidative stress indexes of different pregnancy outcomes in GDM pregnant women（±s）

妊娠結(jié)局剖宮產(chǎn)n是否53 55 t 值P 值巨大兒是否13 95 t 值P 值胎膜早破是否16 92 t 值P 值早產(chǎn)是否12 96 t 值P 值SOD1 4.9±0.8 5.8±1.2 4.568＜0.001 5.6±1.9 5.4±1.0 0.594 0.554 5.2±1.6 5.4±1.1 0.624 0.534 3.8±1.7 5.6±1.2 4.661＜0.001 HO-1 7.7±1.5 6.9±1.4 2.867 0.005 7.8±1.9 7.2±1.3 1.469 0.145 7.1±1.6 7.3±1.4 0.516 0.607 7.9±0.8 7.2±1.1 2.131 0.035 NQO1 6.9±1.6 5.9±1.5 3.352 0.001 6.8±2.1 6.3±1.4 1.130 0.261 6.0±2.0 6.5±1.3 1.300 0.196 7.1±2.2 6.3±1.5 1.645 0.103 Nrf2 5.6±1.1 5.0±1.2 2.706 0.008 5.2±2.1 5.3±1.0 0.287 0.774 5.0±1.8 5.4±1.2 1.134 0.259 5.9±2.2 5.2±1.1 1.815 0.072

3 討論

氧化應(yīng)激由ROS 與抗氧化防御共同調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致組織損傷的重要因素。目前對于GDM 的發(fā)病確切機(jī)制尚未清楚，既往研究表明氧化應(yīng)激在GDM 的病情進(jìn)展中具有重要作用［8］。既往研究［9］主要集中在對GDM 孕婦血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，但胎盤是胎兒與孕婦之間物質(zhì)交換的重要器官，GDM 孕婦機(jī)體存在氧化應(yīng)激的狀態(tài)，其可能直接影響胎盤組織的抗氧化應(yīng)激變化［10］。因此，本研究重點(diǎn)探討GDM 孕婦中胎盤組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況以及其與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

SOD 和GSH 是人體中普遍存在的抗氧化劑，可以保持氧化還原反應(yīng)的平衡［10］，但它們在GDM胎盤組織中的表達(dá)尚未明確。本結(jié)果表明了GDM 孕婦機(jī)體中胎盤組織的抗氧化能力顯著下降。血紅素氧合酶-1（heme oxygenase，HO-1）是一種可誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白，HO-1 被廣泛認(rèn)為是一種高度敏感和可靠的氧化應(yīng)激標(biāo)記物［11］。既往有研究［11］在胎盤的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中觀察到HO-1 的表達(dá)。同時(shí)，NQO1 是Nrf2-ARE 途徑的下游調(diào)節(jié)因子，Nrf2 的過表達(dá)顯著增加了GDM 細(xì)胞中Nrf2 和NQO1 的表達(dá)［12］。Nrf2 抗氧化防御途徑可能為改善與糖尿病相關(guān)的氧化應(yīng)激提供潛在治療靶點(diǎn)［12］。這些數(shù)據(jù)表明氧化應(yīng)激及其相關(guān)分子在GDM 中起重要作用，也表明了胎盤組織的相關(guān)抗氧化因子表達(dá)可能是保護(hù)胎兒的重要途徑。

目前胎盤氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)變化是否會影響孕婦的臨床結(jié)果仍未明確。研究［13］表明，GDM患者的圍產(chǎn)期不良結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)增加，包括巨大兒、宮內(nèi)胎兒死亡、新生兒死亡、難產(chǎn)和先兆子癇。本研究中，SOD、HO-1、NQO1 和Nrf2 水平均與孕婦剖宮產(chǎn)的發(fā)生率密切相關(guān)。既往研究［14］顯示GDM 和巨大兒與SOD 活動受損有關(guān)，GDM 母親及其巨大嬰兒的總血清抗氧化防御狀態(tài)減少。但本研究中是否產(chǎn)巨大嬰兒的孕婦胎盤組織相關(guān)因子表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，這可能是本研究納入的樣本量仍比較少。因此，GDM 孕婦的胎盤組織中存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD，HO-1，Nrf2 和NQO1 可被認(rèn)為是評估GDM 孕婦胎盤和胎兒氧化應(yīng)激的有用標(biāo)志物。

由于本研究的樣本量比較少，仍需要進(jìn)一步加大樣本量和隨訪時(shí)間進(jìn)行評價(jià)。綜合上述，妊娠期糖尿病患者的血清和胎盤組織存在顯著的氧化應(yīng)激狀態(tài)，胎盤組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)與剖宮產(chǎn)及早產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。