LncRNA ROR在脂肪源性干細(xì)胞中的過表達(dá)對(duì)面部皮膚老化的影響

梁書旗 吳新軍 李巖 李建

脂肪源性干細(xì)胞是一類具有分化作用的多功能的干細(xì)胞，近年來在各種損傷修復(fù)中發(fā)揮極其重要的作用［1-2］，其生物學(xué)功能在面部皮膚的保護(hù)和抗衰老中作用尤其突出［3］。隨著社會(huì)的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們生活的壓力越來越大，皮膚老化的速度也越來越快，主要表現(xiàn)為皮膚膠原蛋白減少，失去彈性，皺紋加深，色素沉著，皮膚變得越來越粗糙，因在工作中需要注重形象，所以人們逐漸的開始實(shí)施自我保護(hù)，提高皮膚的光滑程度和細(xì)胞的飽滿程度［4-5］。有研究表明，LncRNA ROR 在人脂肪源性干細(xì)胞中的表達(dá)起到一定的調(diào)控作用，上調(diào)的LncRNA ROR 可能通過正向調(diào)控解偶聯(lián)蛋白-1（Uncoupled protein-1，UCP1）和PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（PR domain protein 16，PRDM16）的表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪源性干細(xì)胞的棕色化［6］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LncRNA ROR 在人脂肪源性干細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)面部皮膚的影響及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年1月本院收治的40例面部老化就醫(yī)者作為研究組。其中男20 例，平均年齡（32.44±3.25）歲；女20 例，平均年齡（34.25±4.25）歲。同時(shí)選取同期到本院健康體檢者40 例作為對(duì)照組，其中男19 例，平均年齡（36.72±3.41）歲；女21 例，平均年齡（35.30±4.26）歲。各組研究對(duì)象臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情且簽署同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①大腿有大量的皮下脂肪；②沒有嚴(yán)重的心腦血管、肝、腎等疾??；③沒有進(jìn)行過面部手術(shù)，患者主動(dòng)就醫(yī)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有免疫功能障礙性疾病患者；②體質(zhì)屬于瘢痕者；③孕婦及哺乳期女性；④年齡未滿18 歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；Prime-Scrip?RT 試劑盒、SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（日本TaKaRa 公司）

1.3 患者脂肪干細(xì)胞的制備

選擇大腿外側(cè)部脂肪細(xì)胞，對(duì)吸脂部位進(jìn)行局部麻醉。使用吸脂針，連接螺旋注射器，由深層向淺層逐層逐漸抽吸100 mL，保證脂肪完整。之后脂肪組織用無菌生理鹽水沖洗，直至無殘留血色全部洗凈，用眼科鑷剔除可見的血管和纖維結(jié)締組織，揀選出脂肪顆粒，然后眼科剪充分剪碎，分裝至離心管中，離心5 min。離心后棄上層油脂及下層沖洗液，將脂肪層重新收集至離心管中，向脂肪組織中加入無菌的體積分?jǐn)?shù)0.1%的Ⅰ型膠原酶，在37℃恒溫?fù)u床震蕩45 min，直到脂肪成糊狀，離心10 min。離心后組織由上而下依次分為為脂肪層、生理鹽水層、沉淀層3 層。取各個(gè)離心管內(nèi)沉淀層，以70 μm篩網(wǎng)過濾，離心5 min，棄上清，加入20 mL 生理鹽水，調(diào)整細(xì)胞濃度為（0.5～1.0）×109/L，備用。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Realtime PCR，qRT-PCR）檢測(cè)LncRNA ROR 的表達(dá)水平

采集Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度與純度。LncRNA ROR 正向引物5′-GTTCCAAACACATCGCCACT-3′，反向引物5′-GGAGTCAGGAGAAGGTGCTG-3′；GAPDH 正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGT GATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA ROR 的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 觀察指標(biāo)

應(yīng)用VISIA 皮膚圖像分析儀對(duì)兩組研究對(duì)象面部斑點(diǎn)、皺紋、皮膚紋理、紫外線色斑進(jìn)行評(píng)分。皮膚檢測(cè)前清理面部，并保持測(cè)量環(huán)境溫度、濕度、光照相對(duì)恒定，清理面部15 min 后應(yīng)用VISIA 皮膚圖像分析儀拍攝測(cè)試者左側(cè)面、正面、有側(cè)面三個(gè)角度面部圖像，盡可能避免毛發(fā)及反光部位干擾，自動(dòng)生成絕對(duì)分值，絕對(duì)分值大小表示所選定區(qū)域皮膚特征面積、密度和強(qiáng)度的綜合考量結(jié)果，由計(jì)算機(jī)計(jì)算出檢測(cè)者三個(gè)角度同一皮膚特征絕對(duì)分值的總和，分值越高說明面部皮膚老化情況越嚴(yán)重［7］。所有皮膚檢測(cè)均由經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的同一人員進(jìn)行操作，符合現(xiàn)行皮膚檢測(cè)基本規(guī)范。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Pearson 法分析LncRNA ROR 與面部皮膚指標(biāo)的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

對(duì)照組與研究組比較，年齡范圍、平均年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料對(duì)比（±s）Table 1 Comparison of two groups of general data（±s）

表1 兩組一般資料對(duì)比（±s）Table 1 Comparison of two groups of general data（±s）

組別對(duì)照組研究組t 值P 值n 40 40年齡范圍（歲）27～48 25～45平均年齡（歲）35.42±4.35 36.81±3.37 1.598 0.114

2.2 兩組LncRNA ROR 表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，研究組LncRNA ROR 的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組LncRNA ROR 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of LncRNA ROR expression levels between the two groups（±s）

組別對(duì)照組研究組t 值P 值n 40 40 LncRNA ROR 1.02±0.13 2.56±0.25 34.565 0.000

2.3 兩組相關(guān)指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，研究組斑點(diǎn)、皺紋、皮膚紋理、紫外線色斑評(píng)分結(jié)果顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組相關(guān)指標(biāo)比較（±s）Table 3 Comparison of related indicators between the two groups（±s）

組別對(duì)照組研究組t 值P 值n 40 40斑點(diǎn)40.44±5.86 60.33±7.89 12.800 0.000皺紋53.43±6.52 65.31±7.62 7.492 0.000皮膚紋理50.36±6.82 63.71±7.30 8.452 0.000紫外線色斑20.28±8.31 35.41±10.20 7.273 0.000

2.4 LncRNA ROR 表達(dá)水平與面部指標(biāo)的相關(guān)性

采用Pearson 法分析LncRNA ROR 表達(dá)水平與面部指標(biāo)斑點(diǎn)、皺紋、皮膚紋理、紫外線色斑的相關(guān)性，結(jié)果顯示，LncRNA ROR 表達(dá)水平與斑點(diǎn)、皺紋、皮膚紋理、紫外線色斑呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

3 討論

面部皮膚老化是一種皮膚質(zhì)量下降的現(xiàn)象，涉及復(fù)雜的生物學(xué)過程，是由于長(zhǎng)期慢性損傷多導(dǎo)致的，分為內(nèi)源性和外源性老化，主要表現(xiàn)為皮膚松弛、皺紋加深、色素增加、毛孔擴(kuò)大等，甚至可能導(dǎo)致皮膚表面出現(xiàn)粉刺、紫癜、疙瘩等。皮膚老化也表現(xiàn)在溫度調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、表皮重建、感覺能力、汗腺分泌、維生素合成和血管生成等皮膚功能方面，這就導(dǎo)致皮膚對(duì)紫外線變得敏感，也進(jìn)一步促進(jìn)皮膚老化［8］。皮膚老化還可引起多種皮膚病的發(fā)生，甚至引起皮膚惡性腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。皮膚的老化主要反映在細(xì)胞水平，等同于細(xì)胞老化，老化細(xì)胞的特征主要有下面這些，例如細(xì)胞的代謝、形態(tài)和內(nèi)容物發(fā)生改變［9］。老化的細(xì)胞盡管喪失了細(xì)胞增殖和分化能力，但仍具有一定的代謝活性。細(xì)胞老化是一種不可逆的過程，所以采取措施延緩細(xì)胞老化是保持皮膚重要方法，這樣也有利于身體健康［10］。

在臨床中，皮膚老化的治療方法有很多，主要是藥物治療和激光治療，但這些方法均不能從源頭上改變發(fā)病的機(jī)理，且容易造成不良后果。脂肪源性干細(xì)胞具有更新復(fù)制和分化的能力，與其他干細(xì)胞相比，脂肪源性干細(xì)胞數(shù)量多，且提取比較方便，所以不僅可以在皮膚的損傷部位長(zhǎng)時(shí)間保留，并且可以通過其分化特征發(fā)揮生物學(xué)功能［11］。有研究表明，單純的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基也能夠在創(chuàng)傷愈合方面發(fā)揮積極作用［12］。

真皮白色脂肪組織（Dermis white adipose tissue，dWAT）是皮膚屏障中的防線，其不僅會(huì)對(duì)毛囊再生帶來直接影響，同時(shí)在皮膚纖維化、傷口愈合及抵抗皮膚感染等過程中也具有協(xié)調(diào)功能［13］。而真皮中有大量具有分化能力的真皮成纖維細(xì)胞（Dermal fibroblasts，dFB），是不成熟脂肪細(xì)胞的主要來源，不成熟脂肪在刺激下會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為dWAT 等成熟脂肪組織，這也是嬰幼兒皮膚飽滿而富有彈性的根本原因，白色脂肪組織會(huì)隨著人體年齡的增加而減少，而表現(xiàn)為逐漸衰老。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路是生物學(xué)中經(jīng)典信號(hào)通路之一，有研究顯示，隨著dFB 抗菌能力及轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞能力不斷下降，TGF-β 信號(hào)處于不斷激活狀態(tài)，使得真皮成纖維細(xì)胞并非向脂肪組織發(fā)展而是向纖維組織發(fā)展［14］。

LncRNA 在人脂肪干細(xì)胞脂向分化中存在差異表達(dá)［15］。LncRNA ROR 是位于人的18 號(hào)染色體，是一種非編碼RNA。栗穎利等［16］研究報(bào)道，LncRNA ROR 參與了棕色脂肪細(xì)胞分化作用，在脂肪源性干細(xì)胞中發(fā)揮非編碼基因的生物學(xué)作用。本研究結(jié)果。提示LncRNA ROR 過表達(dá)可能參與面部皮膚老化的發(fā)生發(fā)展，而其機(jī)制可能與LncRNA ROR 過表達(dá)通過正向調(diào)控UCP1 和PRDM16 的表達(dá)，促使脂肪源性干細(xì)胞棕色化，以及LncRNA ROR 過表達(dá)參與TGF-β 信號(hào)通路的過度激活，并促使真皮成纖維細(xì)胞應(yīng)激性向纖維組織轉(zhuǎn)化，共同導(dǎo)致dWAT 過度減少而加速面部皮膚老化有關(guān)。

綜上所述，LncRNA ROR 過表達(dá)顯著增加了面部皮膚的斑點(diǎn)、皺紋、皮膚紋理及紫外線色斑情況，加速了面部皮膚的老化。