TET1介導5-羥甲基胞嘧啶表達抑制突變型IDH1過表達膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲

雷梓 陳建功 何穎 李睿 吳瑩瑩★

膠質瘤是最常見的原發(fā)性腦部腫瘤之一，呈浸潤性生長，惡性程度高，其中膠質母細胞瘤具有更高的復發(fā)率、致殘率、死亡率，嚴重威脅著人類健康［1］。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變是膠質瘤發(fā)生發(fā)展中重要的分子事件并且可作為分子分型的依據［2］。IDH1 最常見的突變是R132H，占所IDH 突變的80%。有研究顯示IDH1 突變是膠質瘤發(fā)生過程中的早期事件，在膠質瘤的進展以及復發(fā)過程中也起到了重要作用［3］。TET 家族蛋白（ten-eleven translocation protein family，TETs）是一種依賴α-酮戊二酸和Fe2+而發(fā)揮催化活性的雙加氧酶。TETs 是催化DNA去甲基化過程中的第一步，可將5-甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5mc）轉化為5-羥甲基胞嘧（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）非甲基化形式［4］。TET 蛋白介導的DNA 脫甲基化在膠質瘤中起到非常重要的作用［5］。本研究擬探討TEF1 介導的5-羥甲基胞嘧（5hmC）表達對異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）突變的U251 膠質瘤細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人膠質瘤細胞U251 購自武漢普諾賽公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；Trziol 試劑盒、逆轉錄試劑盒購自Invitrogen 公司；IDH1-R132H 突變質粒及TET1 過表達質粒由漢恒生物公司合成；CCK-8 試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自東仁化學公司；細胞周期檢測試劑盒購自七海生物公司；Transwell 小室、Matrigel 基質膠購自美國Corning 公司；IDH1 抗體、TET1 抗體、5hmC 抗體購自Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染

U251 細胞使用含10% FBS 的DMEM（H）培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按照Lipofectamine 2000 轉染試劑盒說明書，細胞融合度達到50%時，IDH1R132H突變質粒及陰性對照質粒轉染細胞，轉染6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞檢測IDH1、TET1 表達水平。細胞轉染IDH1-R132H 質粒48 h 后，繼續(xù)轉染TET1 過表達質粒及過表達對照質粒，轉染48 h 用于后續(xù)檢測5hmC 表達水平及進行功能實驗。

1.3 qRT-PCR 檢測TET1 mRNA 表達

Trizol 試劑盒提取RNA，分光光度計測RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，qRT-PCR擴增目的基因，檢測TET1mRNA 的表達水平，以GAPDH作為內部參照，引物序列見表1。

表1 PCR 擴增引物及條件Table 1 Primers and conditions for PCR amplification

1.4 蛋白免疫印跡法檢測IDH1、TET1 蛋白表達

RIPA 裂解液裂解細胞，離心后收集細胞總蛋白，根據BCA 試劑盒說明書進行蛋白濃度測定；SDS-PAGE 電泳后轉移至PVDF 膜上，室溫封閉1 h，加入一抗（IDH1 抗體，TET1 抗體），4℃冰箱中過夜后室溫復溫，加入酶標二抗，室溫孵育2 h。TBST 洗膜后，ECL 顯色，吸干膜上的水分，化學發(fā)光信號凝膠成像儀采集圖像。

1.5 免疫熒光法檢測5hmC 表達水平

制備細胞爬片，使用4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，室溫通透20 min；5%正常羊血清室溫封閉，加入一抗（5hmC 抗體），4℃冰箱過夜；TBST 漂洗，加入熒光標記二抗，避光、室溫孵育2 h；滴加50 μL的抗淬滅封片劑（含DAPI）封片，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.6 CCK-8 法檢測細胞增殖

轉染48 h 后消化細胞，將細胞接種至96 孔板內，每孔接種1 000 個細胞，每組3 孔重復，每孔加入10 μL CCK-8 試劑后培養(yǎng)箱內孵育2 h，使用酶標儀450 nM 波長下檢測吸光度。

1.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

Ibidi 劃痕插件培養(yǎng)皿置于24 孔板中；胰酶消化收集細胞，調整懸液濃度為2.5×104個/mL；在插件左右孔中各加入100 μL 的細胞懸液；當細胞貼壁后將插件拔出，0、12、24 h 倒置顯微鏡下觀察細胞傷口愈合情況并拍照。

1.8 Transwell 侵襲小室實驗檢測細胞侵襲

使用Matrigel 均勻鋪在Transwell 膜上，37℃干膠；小室上室內加入細胞懸液，下室內加入含20%FBS 的無雙抗DMEM（H）完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h。4%多聚甲醛固定液固定10 min，結晶紫染色30 min 后PBS 清洗，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察并拍照。

1.9 細胞周期檢測

收集細胞，70%預冷乙醇4℃固定過夜，PBS 清洗后，離心收集細胞；用500 μL 結合緩沖液重懸細胞，每管加入12.5 μL PI 和10 μL RnaseA 室溫避光孵育后流式細胞儀下檢測細胞周期。

1.10 細胞凋亡檢測

收集細胞，用100 μL 流式凋亡結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC 染色液和5 μL PI 染色液后室溫避光孵育15 min 后；PBS 將每管液體量補至1 mL 后流式細胞分選儀下檢測細胞凋亡。

1.11 統(tǒng)計學處理

采用SPSS16.0 軟件進行數(shù)據統(tǒng)計學分析，計量資料用（±s）描述，兩組間比較通過t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot 檢測結果

Western blot 檢測結果顯示：與U251-NC 細胞相比，U251-IDHR132H細胞中IDH1 蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A、B），TET1 蛋白表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A、C），免疫熒光檢測顯示U251-IDHR132H細胞中5hmC 的蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 Western blot 檢測結果Figure 1 Western blot results

2.2 人膠質瘤U251 細胞過表達IDH1R132H 與TET1，TET1 及5hmC 表達水平上調

Western blot 檢測結果顯示：與U251-NC 細胞相比，U251-IDHR132H-TET1細胞中TETmRNA及蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2A、B、C），免疫熒光檢測顯示U251-IDHR132H-TET1 細胞中5hmC 的蛋白表達顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2D）。

圖2 U251 細胞過表達IDH1R132H及TET1 后TET1 及5hmC 表達水平Figure 2 Expression levels of TET1 and 5HMC after over expression of IDH1R132h and TET1 in U251 cells

2.3 過表達IDH1R132H 與TET1 促進U251 細胞增殖、遷移、侵襲能力。

與U251-NC 細胞相比，U251-IDHR132H-TET1（U251-TET1）細胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3A），遷移能力降低，侵襲能力降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3B、C）。

2.4 過表達IDH1R132H與TET1 對U251 細胞周期及凋亡的影響

與U251-NC 細胞相比，U251-IDHR132H-TET1 細胞G1 期明顯增加，S 期和G2 期明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細胞凋亡實驗結果顯示與U251-NC 細胞相比，U251-IDHR132H-TET1 細胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

IDH 1 和IDH 2 在人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中所起的重要的作用［6-7］?，F(xiàn)有研究表明，IDH酶通常催化異檸檬酸的脫羧作用生成a-酮戊二酸（a-KG），在此過程中產生還原型輔酶II（NADPH），IDH 1 是人大腦及其他組織中NADPH的主要來源。NADPH 通過減少氧化谷胱甘肽來保護機體免受氧化損傷。IDH 1 通過異檸檬酸氧化脫羧生成NAPDH 以防止脂質過氧化和DNA 氧化損傷［8］。因此，野生型IDH1 和IDH2 在管理氧化應激對各種細胞損傷反應的程度方面起著重要作用。IDH1 突變賦予了一種新的酶活性，催化α-KG 還原成假定的共代謝物D-2-羥基谷氨酸（D2HG）。D2HG 能抑制幾種a-KG 依賴性雙加氧酶活性，包括組蛋白去甲基化酶及10-11 易位-雙加氧酶（TET）家族［9］。TET 蛋白在腺苷三磷酸及二價鐵和α-KG 存在的情況下通過它的結構域能夠催化5-mC 轉變成5-hmC［10］。5mC 和5hmC 表觀遺傳標記的功能的重要性及其調控作用已在許多生物學過程中得到確認［11］。5hmC 被發(fā)現(xiàn)存在于不同種類的細胞內，特別在干細胞和中樞神經細胞內的含量非常高，5-hmC 作為DNA 去甲基化多重步驟中重要的中間產物，其水平在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)生顯著變化［12］。多項研究提示IDH 突變導致腫瘤發(fā)生的一個主要機制是抑制TET 酶以及由此引起的以5hmC 為代表的DNA 去甲基化動力學失調。據此，本研究探討TEF1 介導的5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）表達對異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）突變的U251 膠質瘤細胞生物學行為的影響。

課題組先將IDH1-R132H 突變質粒轉入膠質瘤U251 細胞中，觀察IDH1 突變對細胞中TET1 以及5hmC 表達水平的影響，結果顯示IDH 突變可顯著抑制TET1 及5hmC 的表達。隨后將TET1 過表達質粒轉入IDH1-R132H 突變U251 細胞中，結果顯示TET1 過表達引起了5hmC 水平的升高，顯著抑制了膠質瘤細胞的生長、增殖，促進膠質瘤細胞的凋亡。相關研究發(fā)現(xiàn)，5hmc 表達下降是促進腫瘤進展的表觀遺傳學特征［13］，Xu 等也在液相質譜分析中發(fā)現(xiàn)，IDH 突變導致5hmc 下降，IDH1R132H的表達通過抑制TET 1 和TET2 酶的活性而降低5hmC 在HEK293 細胞中的豐度［14］。這些發(fā)現(xiàn)與本組得出的結果一致，表明IDH 突變導致腫瘤發(fā)生的一個主要機制是抑制TET 酶以及由此引起的以5hmC 為代表的DNA 去甲基化動力學失調，可能為膠質瘤的靶向治療提供新思路。

圖3 過表達IDH1R132H與TET1 促進U251 細胞增殖、遷移、侵襲能力Figure 3 Overexpression of IDH1R132H and TET1 promoted the proliferation,migration and invasion of U251 cells

圖4 過表達IDH1R132H與TET1 對U251 細胞周期及凋亡的影響Figure 4 Effects of overexpression of IDH1R132H and TET1 on cell cycle and apoptosis of U251 cells