Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平與帶狀皰疹患者疼痛程度及并發(fā)后遺神經(jīng)痛的相關(guān)性

宋鐵軍 王亞斐 徐海豐 王心妹 楊會(huì)君

帶狀皰疹（Herpes zoster，HZ）為帶狀皰疹病毒引起的感染性皮膚疾病，可長(zhǎng)期潛伏于人體脊髓神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞中，若病毒激活可導(dǎo)致患者皮膚和外周神經(jīng)侵犯并引發(fā)炎癥反應(yīng)。帶狀皰疹后神經(jīng)痛（postherpetic neuralgia，PHN）為HZ 引起的難治性神經(jīng)病理疼痛綜合征，其在HZ 中發(fā)生率較高，疼痛持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量［1-2］。近年來(lái)研究顯示［3-4］，T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在水痘-帶狀皰疹病毒的潛伏、發(fā)病、復(fù)發(fā)過(guò)程中存在重要作用。輔助性T 細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）及其相關(guān)細(xì)胞因子在免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等多種疾病中具有重要作用，二者在免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化等過(guò)程中相互聯(lián)系、相互制約［5］。另有研究顯示［6］，PHN 患者多容易出現(xiàn)細(xì)胞因子紊亂，且異常表達(dá)的細(xì)胞因子可加劇疼痛并造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷。因此，本研究對(duì)HZ 患者外周血Th17/Treg 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平與疼痛程度及并發(fā)PHZ 的關(guān)系進(jìn)行了探究，以期為PHN 的發(fā)病機(jī)制、臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入本院皮膚科2018年11月至2020年11月收治的168 例帶狀皰疹患者，其中合并PHN 的44例患者作為PHN 組，男性25 例，女性19 例，平均年齡（46.2±3.4）歲，病程平均（3.7±0.7）d；未合并PHN 的124 例HZ 患者作為HZ 組，男性72 例，女性52 例，平均年齡（45.8±3.3）歲，病程，平均（3.7±0.5）d；另選擇同期于本院門診健康體檢的志愿者80 例作為對(duì)照組，均自愿參與本研究。三組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床癥狀和體征符合HZ 及PHN 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②患者及（或）家屬對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書；③發(fā)病時(shí)間7 d 內(nèi)；④能夠配合完成研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他自身免疫性疾病者；②合并嚴(yán)重肝、腎、心等臟器及系統(tǒng)病變者；③合并嚴(yán)重感染、惡性腫瘤患者；④近期應(yīng)用免疫球蛋白、激素、免疫抑制劑者

1.2 方法

1.2.1 視覺模擬評(píng)分（visual analogue scale，VAS）、病情程度評(píng)分評(píng)估［8］

通過(guò)VAS 評(píng)分評(píng)估所有患者疼痛程度［8］，以0～10 分表示，0 分為無(wú)痛，1～3 分輕微疼痛，4～6 分為疼痛明顯但患者尚能忍受，7～10 分為強(qiáng)烈疼痛且難以忍受。根據(jù)水泡數(shù)目、水泡簇?cái)?shù)、瘙癢疼痛、紅斑面積、燒灼感及水泡變化共計(jì)6 個(gè)因子評(píng)估病情嚴(yán)重程度，分?jǐn)?shù)越高，疼痛越嚴(yán)重；其中，＜6分，輕度；6～12 分，中度；＞12 分，重度。

1.2.2 感覺定量測(cè)定

依照Limits 法［9］，以此測(cè)定熱覺（warm sensation，WS）、冷覺（cold sensation，CS）、熱痛覺（heat pain，HP）及冷痛覺（cold pain，CP）。

1.2.3 血清疼痛介質(zhì)水平測(cè)定

所有研究對(duì)象均于入院當(dāng)日清晨抽取3 mL空腹靜脈血，3 000 r/min 離心15 min 分離血清，-20℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定血清β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，β-EP）、血漿P 物質(zhì)（substance P，SP）、神經(jīng)降壓素（neurotensin，NT）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)蛋白（Nerve Growth Factor Inducible，VGF）、降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）水平，試劑盒購(gòu)自上海連邁生物工程有限公司。嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行各項(xiàng)操作。

1.2.4 Th17/Treg 細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定

Treg 細(xì)胞檢測(cè)：所有研究對(duì)象均于入院當(dāng)日清晨抽取3 mL 空腹靜脈血，分離單核細(xì)胞，磷酸緩沖液重懸單核淋巴細(xì)胞，依照Epics XL-MCL 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司）及相關(guān)說(shuō)明書進(jìn)行上機(jī)操作，試劑盒由儀器公司配套提供。

Th17 細(xì)胞檢測(cè)：磷酸緩沖液重懸單核淋巴細(xì)胞，調(diào)整濃度約為1×106個(gè)/mL，依次加入固定液、破膜劑和抗體混合液，避光孵育、離心，磷酸緩沖液沖洗。重懸，上機(jī)檢測(cè)，熒光數(shù)據(jù)以獲得熒光強(qiáng)度＞3 000 個(gè)體細(xì)胞陽(yáng)性，并以每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度表示。

1.2.5 Th17/Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平測(cè)定

采用ELISA 法檢測(cè)白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）水平，試劑盒購(gòu)自?shī)W地利Bender Medsystems 公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；通過(guò)Spearman 相關(guān)系數(shù)分析兩變量之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VAS 評(píng)分、病情程度評(píng)分及感覺定量測(cè)定結(jié)果比較

PHN 組VAS 評(píng)分及病情程度評(píng)分顯著高于HZ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；三組組患者WS、CS、HP 及CP、SP、VGF 和CGRP 水平比較，PHN 組＞HZ 組＞對(duì)照組，β-EP、NT 比較：PHN 組＞HZ 組＞對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組Th17/Treg 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

各組外周血Th17 細(xì)胞、Th17/Treg 及細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α 水平比較，PHN＞HZ＞對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組外周血Treg 細(xì)胞、IL-10、TGF-β1 水平比較，PHN 組＜HZ組＜對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 Th17/Treg 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與PHN、VAS評(píng)分及神經(jīng)損傷的相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)性分析，Th17/Treg、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α 與PHN、VAS 評(píng)分及神經(jīng)損傷（WS、CS、HP、CP）、SP、VGF 和CGRP 存在正相關(guān)性，與β-EP、NT 存在負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）；IL-10、TGF-β1 與PHN、VAS 評(píng)分及神經(jīng)損傷（WS、CS、HP、CP）存在負(fù)相關(guān)性，與β-EP、NT 存在正相關(guān)性（P＜0.05）。見表3。

表1 各組VAS 評(píng)分、病情程度評(píng)分及感覺定量測(cè)定結(jié)果比較（±s）Table 1 Comparison of VAS scores，disease severity scores and sensory quantitative measurement results in each group（±s）

表1 各組VAS 評(píng)分、病情程度評(píng)分及感覺定量測(cè)定結(jié)果比較（±s）Table 1 Comparison of VAS scores，disease severity scores and sensory quantitative measurement results in each group（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與HZ 組相比，bP＜0.05。

指標(biāo)VAS 評(píng)分（分）病情程度評(píng)分（分）WS CS HP CP β-EP（pg/mL）SP（pg/mL）NT（pg/mL）VGF（pg/mL）CGRP（pg/mL）對(duì)照組（n=80）--1.3±0.3 1.6±0.3 1.4±0.1 1.8±0.1 17.7±1.6 2.3±0.2 10.6±1.1 4.2±0.5 3.1±0.4 HZ 組（n=124）5.3±1.8 4.4±1.3 4.7±0.2a 5.9±0.3a 2.0±0.2a 3.3±0.1a 8.4±0.8a 4.2±0.5a 5.7±0.6a 7.9±0.8a 4.6±0.5a PHN 組（n=44）8.1±2.1 9.2±1.5 5.2±0.2ab 6.3±0.2ab 2.3±0.1ab 3.5±0.1ab 5.9±0.6ab 6.6±0.7ab 3.3±0.4ab 13.7±1.5ab 7.9±0.8ab F/t 值8.477 20.193 96.747 116.593 56.921 107.517 61.764 52.829 55.784 53.740 48.000 P 值0.000 0.000 0.000 0.000 0.00 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組Th17/Treg 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 2 Comparison of Th17/Treg cells and related cytokine levels in each group（±s）

表2 各組Th17/Treg 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 2 Comparison of Th17/Treg cells and related cytokine levels in each group（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與HZ 組相比，bP＜0.05。

指標(biāo)Th17（%）Treg（%）Th17/Treg IL-1β（pg/mL）IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL-17（pg/mL）IL-23（pg/mL）TGF-β1（pg/mL）TNF-α（ng/mL）對(duì)照組（n=80）0.8±0.2 2.5±0.4 0.3±0.1 5.6±1.2 3.6±0.7 0.30±0.11 8.6±1.0 0.03±0.01 0.55±0.09 90.2±10.1 HZ 組（n=124）2.0±0.5a 1.8±0.3a 1.1±0.2a 57.1±7.4a 21.3±2.3a 0.20±0.07a 30.2±3.6a 0.14±0.03a 0.41±0.05a 165.9±16.2a PHN 組（n=44）2.4±0.7ab 1.4±0.3ab 1.5±0.3a 90.8±10.6 38.5±3.5ab 0.15±0.06ab 42.0±3.8ab 0.25±0.03ab 0.33±0.04ab 199.5±20.7ab F 值19.657 19.677 33.941 27.585 87.455 10.707 76.027 62.225 19.979 42.445 P 值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Spearman correlation analysis results

3 討論

近年來(lái)研究提示［10］，PHN 患者存在β-EP、SP、NT、VGF 和CGRP 等多種疼痛介質(zhì)的異常變化。β-EP 與NT 為鎮(zhèn)痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)，可提高疼痛閾值，減輕疼痛感覺；CGRP 可抑制P 物質(zhì)分解，增加炎性介質(zhì)水平，增加微循環(huán)通透性，從而加重機(jī)體疼痛；SP 和VGF 為介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，可提高神經(jīng)元興奮，增加患者疼痛感［11-13］。本研究中，PHN 患者較未發(fā)生PHN 的HZ 患者及健康志愿者出現(xiàn)明顯變化，提示HZ 患者疼痛介質(zhì)水平異常與PHN 發(fā)生相關(guān)。PHN 患者存在明顯的周圍神經(jīng)纖維數(shù)量減少，并且其減少程度與溫度覺缺失程度存在密切相關(guān)性。本研究中，在PHN 患者皮疹區(qū)域存在明顯的冷、熱覺及冷、熱痛覺閾值較正常人群升高的情況，提示發(fā)生PHN 的患者相對(duì)于其他HZ 患者存在更加嚴(yán)重的感覺缺失（神經(jīng)功能缺損）。

Th17 和Treg 細(xì)胞均為CD4+T 細(xì)胞的重要亞群，二者各自分化、相互平衡，其水平失衡在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中存在重要作用。Th17 為機(jī)體炎性細(xì)胞，可分泌IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23 等炎性因子參與疾病的發(fā)生發(fā)展；Treg 細(xì)胞則可通過(guò)分泌IL-10、TGF-β1 等抑制性因子負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，發(fā)揮保護(hù)機(jī)體自身耐受的作用。研究認(rèn)為［14］，Th17 和Treg 細(xì)胞在感染性疾病中存在雙面效應(yīng)。本研究探究患者急性期Th17、Treg 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子水平，以分析HZ 患者并發(fā)PHN 過(guò)程中兩種CD4+T 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化和失衡情況。本研究結(jié)果顯示，與HZ 患者及健康志愿者均存在明顯差異。因此，在HZ 患者尤其是發(fā)生PNH的患者中存在Th17 細(xì)胞數(shù)量增加，并導(dǎo)致炎性因子過(guò)量釋放，導(dǎo)致機(jī)體免疫防御機(jī)制被破壞，引發(fā)神經(jīng)損傷，加重局部疼痛反應(yīng)。徐清榜等［15］研究認(rèn)為，Th17 細(xì)胞與HZ 病程相關(guān)，在HZ 及PHN 發(fā)病及發(fā)展中起著重要作用，這與本研究結(jié)果相類似。通過(guò)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg 及其相關(guān)細(xì)胞因子與PHN、疼痛程度、感覺缺失程度、疼痛介質(zhì)水平均存在明顯相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)Th17/Treg 比率失衡及其相關(guān)細(xì)胞因子水平異?？赡苁荘HN 發(fā)生及病情遷延不愈的關(guān)鍵因素。

本研究存在一定的局限性，全身細(xì)胞免疫狀態(tài)受基礎(chǔ)疾病和多種因素的影響，而機(jī)體感染和損傷的免疫反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，隨著疾病發(fā)生機(jī)體可能存在不同的細(xì)胞免疫狀態(tài)，因而存在個(gè)體差異較大的情況，而細(xì)胞因子的來(lái)源也存在一定的多元性。本研究積極排除細(xì)胞免疫狀態(tài)可能受明顯影響的情況，以為臨床研究PHN 的免疫機(jī)制提供有效依據(jù)。綜上所述，HZ 患者存在外周血Th17/Treg 比率明顯升高及相關(guān)細(xì)胞因子水平異常的情況，并與患者并發(fā)PHN、疼痛及病情加重和神經(jīng)損傷密切相關(guān)。