成骨不全XV型WNT1基因突變影響成骨細(xì)胞分化的機(jī)制

張拔山 李榮 王文鋒 周雪明 羅北京 朱梓年 張錫波 丁愛(ài)嬌

成骨不全（Osteogenesis Imperfecta，OI）是一組遺傳性結(jié)締組織疾病，其特點(diǎn)是兒童早期骨脆性增加、骨量減少和骨折頻繁［1］。目前認(rèn)為大約90%的OI 病例是由col1a1 和col1a2 的常染色體顯性突變引起的。然而，大約20%～25%的中度至重度OI 患者在其他基因中存在致病性突變［2］。突變?nèi)鏢ERPINF1、P3H1、CRTAP、PPIB、BMP1、FKBP10、SP7、PLOD2、TMEM38B、PLOD2、P4HB、SPARC 和SEC24 等被認(rèn)為與常染色體隱性O(shè)I 病例密切相關(guān)［3］。此外，研究表明WNT1突變影響成骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致OI 患者骨量紊亂、脆性骨折和進(jìn)行性骨異常［4］。WNT1是Wnt 蛋白家族的一員，在調(diào)節(jié)骨量和維持骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，WNT1缺陷可導(dǎo)致骨形成顯著減少，而WNT1過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)骨形成［5］。在OI 中，研究表明WNT1的雙等位基因突變導(dǎo)致隱性O(shè)I，而WNT1雜合子突變與顯性遺傳家族中的早發(fā)性骨質(zhì)疏松癥相關(guān)［6］。目前為止，已超過(guò)27 種導(dǎo)致WNT1突變的疾病［7］。然而，大多數(shù)WNT1突變的生物學(xué)功能尚未闡明。典型的WNT1通路通過(guò)與細(xì)胞表面的frizzle 和LRP5 受體結(jié)合來(lái)啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致非磷酸化β-catenin在細(xì)胞中的積累，并作為轉(zhuǎn)錄因子來(lái)刺激WNT信號(hào)通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［8］。因此，本研究構(gòu)建 了WNT1野 生 型、WNT1c.110T＞C、WNT1c.505G＞T 和WNT1c.884C＞A 突變質(zhì)粒（陽(yáng)性對(duì)照），并將其轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞（MC3T3-E1），研究突變對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞中WNT1/β-catenin 通路激活的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在添加10%胎牛血清的α-DMEM 中培養(yǎng)成骨前細(xì)胞（MC3T3-E1）。細(xì)胞在37℃的培養(yǎng)箱中在5%的二氧化碳和90%的濕度下生長(zhǎng)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

利用通用生物系統(tǒng)公司（General Biosystems，Inc。）合成野生型WNT1、突變型WNT1c.110T＞C、WNT1c.505G＞T 和WNT1c.884C＞A 質(zhì)粒，以空質(zhì)粒（載體）為陰性對(duì)照，c.884C＞A 為陽(yáng)性對(duì)照。為研究突變對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞的影響，在轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞以5×105的密度接種到6孔板中并培養(yǎng)24小時(shí)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用lipofectin3000 將WNT1、c.110T＞c、c.505G＞T 和c.884C＞a轉(zhuǎn)染到每個(gè)孔中的細(xì)胞。

1.3 熒光定量PCR（qPCR）

用TRIzol 試劑（美國(guó)英杰）從MC3T3-E1 細(xì)胞中分離總RNA。用隨機(jī)引物，用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。WNT1、BMP2和RANKL使用SYBR 實(shí)時(shí)PCR 主混合試劑盒（日本東洋紡）進(jìn)行擴(kuò)增，特異引物如下：WNT1正向：5′-CGATGGGGGTATTGGAAC-3′，WNT1反向：5′-CCGGATTTGGTATCAGAC-3′，BMP2正向：5′ -GGGACCCTGTTCTAGT-3′，BMP2反向：5′ -TCAATCAGATTCAGAC-3′，RANKL正向：5′-AGGCTGGGCCAAGATCTCTA-3′，RANKL反向：5′-GTCTGTAGGTACGCTTCCCG-3′。WNT1、BMP2和RANKL的相對(duì)表達(dá)用2-ΔΔct法計(jì)算。以GAPDH 為內(nèi)對(duì)照：GAPDH正向：5′-ATCAAGTGGGGTGATGCTGG-3′，反向：5′-CCTGCTTCACCACC TTCTTGA-3′。此外，進(jìn)行了三個(gè)獨(dú)立的分析。

1.4 免疫印跡法

用添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞。蛋白質(zhì)濃度用蛋白定量試劑盒（美國(guó)皮爾斯）定量。蛋白質(zhì)（40 μg/樣品）在10%SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉后，將原代WNT1、non-p-β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、BMP2和RANKL 抗體和相應(yīng)的HRP 二級(jí)抗體。用化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)默克密理博）觀察印跡。用Image-Pro 軟件將蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GADPH。

1.5 免疫熒光法

用WNT1c.110T＞C、c.505G＞T 和c.884C＞A 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h 后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用0.5% Triton-100 滲透，用5% BSA 封閉。接下來(lái)，細(xì)胞用WNT1、β-catenin、non-p-β-catenin、GSK-3β 和p-GSK-3β 一級(jí)抗體和FITC 結(jié)合的二級(jí)抗體培養(yǎng)。熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性信號(hào)。DNA用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色5 min。

1.6 3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H 四唑鹽（MTS）分析

轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96 孔板中24 小時(shí)。用WNT1c.110T＞C、c.505G＞T和c.884C＞A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞繼續(xù)在添加有20 μL CellTiter 96 水溶液試劑的α-DMEM（100 μL）中培養(yǎng)4 小時(shí)。在492 nm 處使用96 孔板閱讀器（美國(guó)伯樂(lè)）測(cè)定細(xì)胞活力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)；計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WNT1 c.110T＞C 和c.505G＞T 突變影響MC3T3-E1 的增殖

MC3T3-E1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，WNT1野生型細(xì)胞活性顯著高于空載組、c.505G＞T 及c.884C＞A 突變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染48 h 后，野生型細(xì)胞在490 nm 處檢測(cè)到的吸光度（OD）值為（0.512±0.029)，而c.110T＞C 和c.505G＞T 突變型細(xì)胞OD 值分別為（0.440±0.042）、（0.458±0.014），各組間OD 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.324，P＜0.05），且WNT1 野生型細(xì)胞活性顯著高于c.110T＞C 和c.505G＞T 突變型細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 WNT1 c.110T＞C、c.505G＞T 和c.884C＞A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細(xì)胞24、48 h 的存活率Figure 1 Viability of MC3T3-E1 cells after transfection with Vector，WNT1 c.110T＞C，c.505G＞T，and c.884C＞A plasmids at 24 and 48 h

2.2 WNT1 c.110T＞C 和c.505G＞T 突變影響成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

BMP2mRNA 的表達(dá)水平在WNT1野生型細(xì)胞，c.110G＞T 突變細(xì)胞，c.505C＞A 突變細(xì)胞以及c.884C＞A 突變細(xì)胞的表達(dá)量與突變細(xì)胞株比較，BMP2在野生型細(xì)胞株中表達(dá)顯著升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=376.210，P＜0.05）；RANKLmRNA 的表達(dá)量在WNT1 野生型細(xì)胞，c.110G＞T 突變細(xì)胞，c.505C＞A 突變細(xì)胞以及c.884C＞A 突變細(xì)胞與突變細(xì)胞株比較，RANKLmRNA 在野生型細(xì)胞株中表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.940，P＜0.01，P＜0.05），見(jiàn)圖2A、2B。WB 結(jié)果在蛋白水平上證實(shí)，與突變細(xì)胞株相比，BMP2mRNA 在WNT1野生型細(xì)胞株中顯著高表達(dá)（F=480.532，P＜0.05），而RANKLmRNA 在WNT1 野生型細(xì)胞株中顯著低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=201.510，P＜0.05），見(jiàn)圖2C、圖2D、圖2E。

2.3 WNT1 c.110T＞C 和c.505G＞T 突變影響WNT/β-catenin 信號(hào)通路

WNT1mRNA 的表達(dá)水平在空載組，c.110T＞C突變型組，c.505G＞T 突變型組和野生型組細(xì)胞中的表達(dá)量與空載組比較，WNT1在野生型組與突變型組細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）(圖3A)。WB 和IF 分析表明，WNT1的相對(duì)灰度值（integrated density value，IDV）在野生型組細(xì)胞，c.110T＞C 突變型組細(xì)胞與c.505G＞T 突變型組細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載組細(xì)胞相比，WNT1在野生型和突變型細(xì)胞中表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3B、3C 和圖4。非磷酸化βcatenin（non-p-β-catenin）的IDV 在WNT1野生型細(xì)胞，c.110T＞C 突變細(xì)胞株，c.505G＞T 突變細(xì)胞株及c.884C＞A 突變細(xì)胞株與WNT1野生型細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染突變WNT1基因的細(xì)胞中non-p-β-catenin 的表達(dá)顯著下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）的IDV 在WNT1野生型細(xì)胞，c.110T＞C 突變細(xì)胞株，c.505G＞T 突變細(xì)胞株及c.884C＞A突變細(xì)胞株與WNT1野生型細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染突變WNT1基因的細(xì)胞中p-GSK-3β 的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3D、3E 和圖4。

圖2 WNT1 突變對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞BMP2 和RANKL mRNA 及蛋白表達(dá)水平的影響Figure 2 Effects of WNT1 mutation on the mRNA and protein expression levels of BMP2 and RANKL in MC3T3-E1 cells

圖3 轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT1 野生型和突變質(zhì)粒的細(xì)胞中WNT1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平及與WNT/β-catenin 信號(hào)通路Figure 3 The mRNA and protein expression levels of WNT1 and important factors related to the WNT/β-catenin signaling pathway in cells transfected with WNT1 wild-type and mutant plasmids

3 討論

以往研究表明，在四個(gè)獨(dú)立家譜的外周血樣本中發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的WNT1 雜合突變（c.110T＞C、c.505G＞T、c.385G＞A 和c.506G＞A）與OI 相關(guān)［4］。其中，位于外顯子2 的錯(cuò)義突變（WNT1c.110T＞C）可導(dǎo)致異亮氨酸轉(zhuǎn)化為蘇氨酸。此外，外顯子3 的錯(cuò)義突變（c.505G＞T）導(dǎo)致半胱氨酸取代甘氨酸。目前，這些突變的生理意義尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，突變c.110GT＞C 和c.505G＞T 能夠抑制MC3T3-E1細(xì)胞活性。同時(shí)研究揭示了WNT1c.110T＞C 和c.505G＞T 突變對(duì)成骨細(xì)胞增殖和WNT1/β-catenin信號(hào)通路的影響。野生型WNT1 可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物BMP2 的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞分化標(biāo)記物RANKL，激活WNT1/β-catenin 信號(hào)通路，但當(dāng)WNT1c.110T＞C 和c.505GT＞突變時(shí)，這些效應(yīng)明顯受抑制。此外，骨質(zhì)疏松癥是OI 患者的一個(gè)重要特征［9］。研究表明，BMP2 和RANKL 分別誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化［10-11］，WNT1 缺陷小鼠的成骨細(xì)胞活力降低，并與骨折表型相關(guān)［12］。本研究結(jié)果說(shuō)明WNT1的c.110T＞C 和c.505G＞T 突變導(dǎo)致成骨細(xì)胞發(fā)育不良，抑制骨形成，容易增加骨質(zhì)疏松和骨折的風(fēng)險(xiǎn)。

此外，研究還表明，WNT1 突變可通過(guò)使典型WNT 途徑失活而導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)的變化［13］。盡管一些突變形式誘導(dǎo)WNT1 信號(hào)通路的激活，但WNT 信號(hào)通路下游目標(biāo)基因的表達(dá)失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞礦化受損［6］。WNT 與Frizzled/LRP5/6 復(fù)合物共同激活WNT/β-catenin 信號(hào)通路，介導(dǎo)β-catenin 的激活，進(jìn)而激活下游基因的表達(dá)。當(dāng)存在WNT 信號(hào)時(shí)，GSK-3β 介導(dǎo)的β-catenin 水解被抑制，β-catenin 的下游靶基因可以被激活［14］。本研究結(jié)果顯示，與野生型WNT1 組相比，c.110T＞C 和c.505G＞T 突變降低了GSK-3β 和非β-catenin 水平，提示W(wǎng)NT1 的c.110T＞C 和c.505G＞T 突變可能與WNT 激活減少和典型WNT/β-catenin 信號(hào)通路的激活降低有關(guān)，然而確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，WNT1基因c.110T＞C 和c.505G＞T突變對(duì)WNT 信號(hào)通路的影響可能是導(dǎo)致OI 的原因。WNT1c.110T＞C 和c.505G＞T 突變可作為OI 早期篩查的候選靶點(diǎn)參考。