三七總皂苷白蛋白微球注射液的初步穩(wěn)定性研究*

楊 姍，陳汝玲，吳靜瀾，代政敏

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

中藥注射劑是傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代生產(chǎn)工藝相融合的產(chǎn)物，突破了中藥傳統(tǒng)的給藥方式，中藥注射劑與中藥傳統(tǒng)制劑相比，不僅保留了中醫(yī)藥傳統(tǒng)的辯證論治的特點，還具備了注射劑生物利用度高、作用迅速、療效確切等特點[1-2]。PNS-BSA-MS-inj是實驗室自制的一種以三七總皂苷白蛋白微球(PNS-BSA-MS)為原料藥，以注射用透明質(zhì)酸鈉為注射介質(zhì)在無菌條件下制備而得的用于關(guān)節(jié)腔注射治療骨性關(guān)節(jié)炎的一種注射制劑。PNS-BSA-MS-inj的主要成分是三七總皂苷，研究表明，三七總皂苷除具有抑制促炎癥因子分泌、抑制金屬蛋白酶的活性、保護軟骨基質(zhì)、抑制滑膜炎癥等作用外，還可用于治療骨性關(guān)節(jié)炎[3]。中藥注射劑的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，不僅是國家政策的需要，也是中藥注射劑本身發(fā)展的需要[4]。為考察制劑質(zhì)量穩(wěn)定性以及藥物在貯存過程中的影響因素，本研究對PNS-BSA-MS-inj的穩(wěn)定性進行研究。重點考察了PNS-BSA-MS-inj在多個存放條件下的穩(wěn)定性。通過影響因素試驗考察其在高溫、冷藏、冷凍條件下的穩(wěn)定性；對其進行加速穩(wěn)定性試驗考察，考察注射劑中的主要成分隨時間變化規(guī)律，對PNS-BSA-MS-inj有關(guān)物質(zhì)進行測定，通過性狀檢查、pH值檢查、有關(guān)物質(zhì)測定、樹脂的測定、可見異物測定、微球形態(tài)檢查，評價其有關(guān)物質(zhì)對其穩(wěn)定性的影響。通過對PNS-BSA-MS-inj的穩(wěn)定性研究為建立該制劑的有效期和穩(wěn)定性評價提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；HT-220A 型柱溫箱(日本島津公司)；Wondasil C18(5 μm，46×250 mm，日本島津公司)；HWHS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱(金壇市瑞華儀器有限公司)；YB-2型澄明度檢查儀(天津藥典標準儀器廠)；FCD-270SF型冷藏冷凍柜(青島海爾特種電冰柜有限公司)；YC-260L型醫(yī)用冷藏箱(中科美菱低溫科技股份有限公司)；DKZ-2型點熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；JA-2003電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；SKB200H型臥式超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；XSP-OO型光學顯微鏡(深圳市恒盛豐工貿(mào)有限公司)；PHS-3C型精密pH計(上海虹益儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑與試藥

PNS-BSA-MS注射液(批號：20171027、20171028、20171029，實驗室自制)；三七總皂苷(純度≥80%，批號：YS-SQ-141127；西安源森生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(純度≥98%，批號：20170712002，上海鼓臣生物試劑有限公司)；三七皂苷R1對照品(批號：110745-201619，中國食品藥品檢定研究院)；人參皂苷Rg1對照品(批號：110703-201731，中國食品藥品檢定研究院)；人參皂苷Rb1對照品(批號：110704-201625，中國食品藥品檢定研究院)；pH緩沖劑(批號：20150601，天津市科密歐化學試劑有限公司)；胃蛋白酶(批號：20170215，南京奧多福尼王物科技有限公司)；甲醇(色譜純，批號：20161116，國藥集團化學試劑有限公司)；蓖麻油(分析純，批號：20171202，西隴化工股份有限公司)；乙醚(分析純，批號：20160224，國藥團化學試劑有限公司)；透明質(zhì)酸鈉(分析純，批號：161114，華熙福瑞達生物藥有限公司)；娃哈哈純凈水(娃哈哈集團有限公司)；雞蛋購買于合力超市。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備

稱取三七皂苷R1對照品，人參皂苷Rb1對照品，人參皂苷Rg1對照品適量，精密稱定，置于25 mL的干燥容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度線，然后搖勻，即得濃度為42.8 μg·mL-1的三七皂苷R1對照品溶液、57.84 μg·mL-1的人參皂苷Rg1對照品溶液、41.76 μg·mL-1的人參皂苷Rb1對照品溶液。

2.1.2 緩沖溶液的制備

將pH≈9的緩沖劑在25 ℃下倒入250 mL容量瓶中，以少量無CO2蒸餾水沖洗塑料袋內(nèi)壁，并在25 ℃定容到刻度，搖勻，即得pH=9.18的緩沖溶液。取pH=9.18緩沖溶液適量，加入少量磷酸并用精密pH計調(diào)至pH=2.5，備用。

2.1.3 0.5%胃蛋白酶溶液的制備

稱取胃蛋白酶適量，置于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水使胃蛋白酶溶解并定容至刻度線，搖勻，即得0.5%胃蛋白酶溶液。

2.1.4 PNS-BSA-MS注射劑樣品溶液的制備

取PNS-BSA-MS-inj 1支(2 mL)，用1 mL注射器置于50 mL錐形瓶中。精密吸取8 mL 2.1.2項下緩沖溶液，以及6 mL 0.5%胃蛋白酶溶液，放于恒溫振蕩水槽中振搖12 h后，取出。將錐形瓶內(nèi)的溶液倒入至蒸發(fā)皿中，置于水浴上，揮干，殘渣用甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻。用1 mL注射器吸取1 mL樣品試液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得PNS-BSA-MS-inj樣品溶液[5]。

2.2 色譜條件

色譜柱為Wondasil C18(5 μm，46×250 mm)，以乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)為流動相，梯度洗脫：(0～20 min，22% A；20～30 min，22%～28% A；30～60 min，28%～43% A)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為203 nm，進樣量為20 μL。

2.3 考察方法

本試驗參照《中國藥典》2015版四部通則原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則[1]，對PNS-BSA-MS-inj進行影響因素試驗(高溫試驗、冷藏試驗和冷凍試驗)和加速穩(wěn)定性試驗考察。通過性狀檢查、pH值檢查、有關(guān)物質(zhì)測定、樹脂的測定、可見異物測定、微球形態(tài)檢查，評價其有關(guān)物質(zhì)對其穩(wěn)定性的影響。

2.4 影響因素試驗

2.4.1 高溫試驗

取同一批次(20171008)的PNS-BSA-MS-inj，放入燒杯中，將其置于40 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中放置10 d，于0 d、5 d、10 d時取樣觀察PNS-BSA-MS-inj外觀、pH值、可見異物等和微球載藥量(三七總皂苷含量)變化，結(jié)果如表1。

2.4.2 冷藏試驗

取同一批次(20171008)的PNS-BSA-MS-inj，將其置于4 ℃的醫(yī)用冷藏箱中進行冷藏試驗，放置10 d，于0 d、5 d、10 d時取樣觀察PNS-BSA-MS-inj外觀、pH值、可見異物等和微球載藥量(三七總皂苷含量)變化，結(jié)果見表1。

2.4.3 冷凍試驗

取同一批次(20171009)的PNS-BSA-MS-inj，將其置于-10 ℃的電冰柜進行冷凍試驗，放置10 d，復(fù)融后取樣觀察PNS-BSA-MS-inj外觀、pH值、可見異物等和微球載藥量(三七總皂苷含量)變化，結(jié)果見表1。

表1 PNS-BSA-MS-inj影響因素試驗結(jié)果Tab.1 Results of influencing factors test of PNS-BSA-MS-inj

結(jié)果表明PNS-BSA-MS-inj在40 ℃高溫條件下放置10 d后，注射劑中微球總載藥量明顯下降；外觀變化也很明顯，由原來的混懸型注射劑變成了分層，且PNS-BSA-MS都在下層粘結(jié)成團。PNS-BSA-MS-inj在4 ℃冷藏條件下的穩(wěn)定性良好，冷藏10 d后的微球總載藥量在變化范圍之中，三七總皂苷的含量變化不明顯，外觀變化也不顯著，各項檢查也達到要求。冷凍試驗結(jié)果表明，PNS-BSA-MS-inj在-10 ℃冷凍條件下放置10 d后，PNS-BSA-MS-inj中微球的含量有所下降，且性狀變化明顯，冷凍保存前微球的形態(tài)是圓整，均勻分散，經(jīng)冷凍保存10 d后取出，復(fù)融后輕搖不能恢復(fù)均勻，PNS-BSA-MS-inj有部分微球粘連在一起。說明PNS-BSA-MS-inj不適于在高溫和冷凍條件下貯存，在4 ℃條件下適宜貯藏。

2.4.4 加速穩(wěn)定性試驗

取三批次(20171027，20171028，20171029)的PNS-BSA-MS-inj，將其置于溫度為25 ℃±2 ℃條件下進行試驗，分別于0、1、2、3、6月末對 PNS-BSA-MS-inj進行性狀、粒徑、pH值、鞣質(zhì)、樹脂、可見異物檢查和微球載藥量(三七總皂苷含量)測定，結(jié)果見表2。

表2 PNS-BSA-MS-inj加速試驗結(jié)果Tab.2 Results of accelerated stability test of PNS-BSA-MS-inj

如表2所示，在6個月的加速穩(wěn)定性試驗過程中，PNS-BSA-MS-inj中主要有效成分三七皂苷R1在試驗期間含量變化相對穩(wěn)定，但是人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量整體呈減小趨勢，而pH值、微球形態(tài)、可見異物及有關(guān)物質(zhì)等考察指標與0月相比均無明顯變化。1個月內(nèi)注射劑基本都是混懸狀態(tài)或者不需要很用力震搖就能恢復(fù)混懸狀態(tài)，但從1個月以后微球粘附在安瓿瓶壁上很嚴重，且時間越長需要用力震搖才能讓其恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)，說明PNS-BSA-MS-inj不適合常溫長時間存放。

3 討論

藥品的穩(wěn)定性是用來衡量藥品質(zhì)量的重要標準之一，而安全性和有效性均是以穩(wěn)定性為基礎(chǔ)的[6]。由于中藥成分復(fù)雜，其穩(wěn)定性研究難度相對于化學藥品更大。中藥注射劑作為現(xiàn)代化中藥制劑，是中藥現(xiàn)代化的重要產(chǎn)物，但中藥注射用藥與口服用藥相比，其風險增加。因此，中藥注射劑穩(wěn)定性研究是保證其臨床安全有效的重要研究內(nèi)容[7]。本實驗所用的注射劑是以透明質(zhì)酸鈉為注射介質(zhì)，PNS-BSA-MS為原料藥混合制成的一種淡黃白色的混懸型注射劑，重點考察PNS-BSA-MS注射劑在冷藏、冷凍、高溫及加速試驗條件下的穩(wěn)定性。根據(jù)中藥新藥穩(wěn)定性研究的要求，對本品在模擬市售玻璃安瓿包裝條件下，采用影響因素試驗及加速穩(wěn)定性試驗對PNS-BSA-MS-inj的穩(wěn)定性進行考察，結(jié)果表明，PNS-BSA-MS-inj在冷藏條件下的穩(wěn)定性良好，但在高溫條件下性狀及含量變化較大，冷凍條件下微球有所粘結(jié)，含量有所下降，可能跟微球粘附在安瓿瓶壁上有關(guān)。說明PNS-BSA-MS-inj在高溫及冷凍條件下的穩(wěn)定性較差，低溫冷藏條件下的穩(wěn)定性較好，故建議將PNS-BSA-MS-inj保存在低溫避光條件下，且不要長時間放置。