子宮頸癌及病變中信號通路Shh蛋白與p-STAT3的表達及臨床意義

郭靈敏 ，林 芳，李林株，杜佩銘，區(qū)承昌

(佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院：1.病理科；2.婦產(chǎn)科，廣東 佛山 528500)

宮頸癌是人類女性中高發(fā)的一種癌癥，發(fā)病率和死亡率僅低于乳腺癌，近些年頻發(fā)且有年輕化趨向[1]，很多患者在就醫(yī)時已確診為浸潤癌，因而在上皮內(nèi)病變和早癌時期發(fā)現(xiàn)并治療便顯得尤為重要。一般情況認(rèn)為宮頸癌變過程與高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)相關(guān)，但單發(fā)因素不足以引起癌變，目前宮頸癌發(fā)病的病理尚未明確，因此對其分子機制的研究極其重要。Hedgehog(HH)是經(jīng)典的胚胎發(fā)育信號通路，有報道該通路多種因子在胃、肺及胰腺等部位癌組織中有異?；罨捅磉_，該通路的激活對腫瘤的增殖與分化起重要作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)為一種癌基因[2]，其過度活化與多種癌癥的產(chǎn)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。目前國內(nèi)外尚缺乏關(guān)于HH通路、p-STAT3蛋白同時在宮頸鱗癌的研究。本實驗用免疫組織化學(xué)(免疫組化)標(biāo)記刺猬蛋白(Shh)及p-STAT3在宮頸組織不同病變中的表達，并分析宮頸鱗癌與臨床各因素的關(guān)系，為治療和預(yù)后預(yù)測提供新的病理評估依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2015年1月至2018年12月病歷齊全的宮頸鱗狀細(xì)胞癌(SCC)患者標(biāo)本45例(SCC組)、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)患者標(biāo)本35例(HSIL組)、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)患者標(biāo)本35例(LSIL組)，并將因非腫瘤性疾病而子宮全切患者的正常宮頸組織(NC)30例作為對照組。SCC組45例患者術(shù)前均未進行放化療，并經(jīng)病理確診，年齡28～77歲，平均(47.56±11.24)歲；淋巴轉(zhuǎn)移17例，無淋巴轉(zhuǎn)移28例；臨床分期采用FIGO方案，Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期21例；病理組織類型：均為鱗狀細(xì)胞癌；病理分級：Ⅰ級15例，Ⅱ級18例，Ⅲ級12例。各組患者一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)以《2019年NCCN宮頸癌臨床實踐指南(第1版)》[3]為參考，術(shù)前經(jīng)陰道鏡活檢或術(shù)中冰凍診斷為SCC，且經(jīng)根治術(shù)后病理診斷一致；(2)研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者術(shù)前已進行放療或化療；(2)患者僅宮頸脫落細(xì)胞學(xué)診斷無術(shù)后診斷；(3)未行根治手術(shù)患者的標(biāo)本；(4)病歷不完整者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理 所有標(biāo)本組織均通過10%甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)4 μm切片后進行免疫組化En-Vision兩步法染色，流程按商品規(guī)范進行，脫蠟水化、檸檬酸鹽緩沖液(pH 9.0)高溫高壓熱修復(fù)，3%過氧化氫阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，樹膠封片。一抗均購自Santa Cruz biotechnology公司，分別是兔抗人單克隆抗體Shh、兔抗人單克隆抗體p-STAT3，適用稀釋濃度1∶100，DAB顯色劑及En-Vision法試劑盒購于丹麥Dako公司。均使用試劑盒提供的陽性組織作為陽性對照，以PBS緩沖液替代一抗作陰性對照。

1.2.2判定標(biāo)準(zhǔn) Shh以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃或棕褐色判定為陽性，p-STAT3以細(xì)胞核呈棕黃或棕褐色判定為陽性。觀察10個有代表性的高倍(400×)視野計1 000個腫瘤細(xì)胞，計算平均陽性率，利用雙評分半定量計分法判斷染色情況[4]：以大部分細(xì)胞顯示的染色狀態(tài)為指標(biāo)對著色程度評分，無色為0分,淺黃色記1分,棕黃色記2分,棕褐色記3分；陽性細(xì)胞數(shù)百分比小于或等于5%記0分，>5%～25%記1分，>25%～50%記2分，>50%記3分。兩積分相乘，0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，>3～5 分中度陽性(++)，>5分為強陽性(+++)。

2 結(jié) 果

2.1Shh、p-STAT3在宮頸不同病變中的表達特點及差異 Shh及p-STATA3在NC組織中陰性表達或偶爾弱陽性表達，各組Shh及p-STATA3的陽性表達率分別為：NC組3.3%和16.7%，LSIL組28.6%和20.0%，HSIL組37.1%和60.0%，SCC組71.1%和64.4%，隨著腫瘤的進展，2種蛋白的陽性表達率和表達強度均增加。Shh在各組間陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=37.321，P<0.05)；LSIL組與SCC組間、HSIL組與SCC組間Shh陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而LSIL組與HSIL組間Shh陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。p-STAT3在各組間陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=28.648，P<0.05)；LSIL組與SCC組間、HSIL組與LSIL組間p-STAT3陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而LSIL組與NC組間、HSIL組與SCC組間p-STAT3陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2Shh、p-STAT3與宮頸癌臨床因素的關(guān)系 Shh、p-STAT3的表達與患者的臨床分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。隨著分級分期的增加兩者表達遞增，且表達增強，即與鱗癌的病變進展相關(guān)，而與患者的年齡、腫瘤大小無相關(guān)性(P>0.05)見表2。

表1 Shh、p-STAT3在宮頸不同病變中的表達比較

表2 Shh、p-STAT3與宮頸癌臨床因素的關(guān)系

2.3宮頸癌/病變Shh、p-STAT3表達的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，SCC組中，Shh、p-STAT3表達呈正相關(guān)[相關(guān)系數(shù)(r)=0.448,P=0.002)]，見表3。在HSIL組中，Shh、p-STAT3表達呈正相關(guān)(r=0.386,P=0.022)；而在LSIL組中，Shh、p-STAT3表達無相關(guān)性(r=0.316,P=0.064)。

表3 宮頸癌/病變Shh與p-STAT3表達的相關(guān)性(n)

3 討 論

近年來，宮頸癌發(fā)病率一直增長，已位居女性癌癥中發(fā)病率第2位，且患者多為鱗癌(占75%～80%)，發(fā)病誘因包括HPV病毒感染、免疫低下紊亂等因素。作為一種涉及腫瘤基因激活且抑癌基因失活的疾病[5]，染色體突變、缺損與信使蛋白的異常表達在宮頸鱗癌的產(chǎn)生、進展及侵犯轉(zhuǎn)移中起著不可或缺的作用。宮頸鱗癌是由宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)展而來，從感染病毒到癌時間跨度可有10年，雖然細(xì)胞學(xué)、HPV病毒等初篩手段的廣泛運用，極大地減少了宮頸癌的發(fā)生，但因為對鱗狀上皮的癌性增生缺少分子級的研究，很多患者在入院時已確診為癌癥，且出院后即便進行綜合性治療，5年生存率不到40%，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率也高[6]。因此，早發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)病變甚至早期鱗癌對增加患者存活率意義重大。

近年來發(fā)現(xiàn)，一些信號通路不僅在胚胎細(xì)胞發(fā)育、組織分化中起重要作用，也調(diào)控著腫瘤的產(chǎn)生和進展，CARBALLO等[7]研究顯示，激活的HH通路不僅在組織的發(fā)育中起重要作用，還與多種癌癥的產(chǎn)生及進展有密切關(guān)系。HH基因在1980年被發(fā)現(xiàn)，其具有表面突起的特征而稱為“刺猬蛋白”。HH成員包含Sonic Hedgehog(SHh)、Desert Hedgehog(DHh)及Indian Hedgehog(IHh)，其中SHh是最類似人基因組的，且生物學(xué)意義最重要，Shh是SHh通路中一個重要啟動基因，通過編碼Shh配體，與靶細(xì)胞膜上的Ptch轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合，促使Smo激活下游基因Gli，活化的Gli進入胞核激活目的基因而發(fā)揮作用，因而Shh蛋白的增多可作為Shh通路活化的標(biāo)識。BENESCH等[8]認(rèn)為在分化成熟的宮頸上皮中，Shh在維持宮頸的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用。已有多項研究表明Shh異常激活能導(dǎo)致多類腫瘤的產(chǎn)生,如前列腺癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸胰腺腫瘤等[9]，并且發(fā)現(xiàn)其在不同組織中的活化機制也不一致，比如Shh配體表達增多，Ptch、Smo基因突變等[10]。其他研究也發(fā)現(xiàn)Shh的活化可同時激活目標(biāo)基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，促進脈管生成，加快腫瘤生長、侵犯和轉(zhuǎn)移[11]。本研究探討了Shh在鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展當(dāng)中的變化過程，發(fā)現(xiàn)正常上皮基本陰性或偶爾表達，而其在SIL、SCC中的陽性率遞增，陽性強度也更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Shh的過度激活是鱗癌發(fā)病過程中的早期改變，支持上皮內(nèi)病變與癌為連續(xù)病變過程的同一疾病。Shh與宮頸鱗癌的臨床進展呈正相關(guān)，特別是FIGO分期高、分級高和伴有淋巴轉(zhuǎn)移的情況，說明隨著病變進展，Shh表達上調(diào)且預(yù)后不良。

酪氨酸激酶STATs是人體又一條重要的信號通路，STAT3一開始是研究細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與干擾素的關(guān)系時被發(fā)現(xiàn)的[12]，作為STATs中的重要部分,接受來自上游的生物活性因子或其他多肽配體活化，發(fā)生酪氨酸磷酸化以二聚體狀態(tài)進入細(xì)胞核與目標(biāo)基因的啟動子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游蛋白如B淋巴細(xì)胞癌-2基因、細(xì)胞周期蛋白D1、VEGF等的表達[13]。正常情況下激活會在短時間內(nèi)脫磷酸化而使STATs失效，而腫瘤狀態(tài)下則是持續(xù)激活，從而在腫瘤的增生和凋亡、侵犯和轉(zhuǎn)移等進程中起主要調(diào)節(jié)作用，被廣泛且深入地探討，諸如乳腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤和白血病[14]等多種病變中過表達。研究顯示，STAT3除了參與癌的形成和進展，還與腫瘤游走、免疫逃逸及脈管形成等緊密相關(guān)[15]。實驗結(jié)果顯示p-STAT3主要表達于細(xì)胞核，這種表達的定位與細(xì)胞內(nèi)STAT3信號傳導(dǎo)流程一致。本研究結(jié)果顯示，p-STAT3在宮頸病變的陽性率遞增，LSIL組及SCC組與HSIL及LSIL組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明p-STAT3在宮頸癌的產(chǎn)生、進展中起促進作用。同時p-STAT3與組織分級、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明STAT3在宮頸癌的分化過程和淋巴轉(zhuǎn)移中起重要作用，可能是通過激活下游相關(guān)靶基因，加速細(xì)胞增殖并阻斷凋亡。

本研究結(jié)果表明，Shh在SCC組中的陽性率高于SIL組及NC組，且SIL組均高于NC組，顯示Shh活化發(fā)生在宮頸病變早期。p-STAT3在SCC組及HSIL組的陽性率高于LSIL組及NC組，SCC組與HSIL組無明顯差異，相較于Shh，p-STAT3發(fā)揮的時間較晚，主要在宮頸高度病變及癌階段,說明p-STAT3在宮頸早期病變中未能扮演重要角色，無過表達，而后期HPV整合到宿主DNA后會在一些因子刺激下過表達。此外相關(guān)性研究顯示，2種蛋白在宮頸HSIL和宮頸癌中呈正相關(guān)，說明兩通路存在相關(guān)聯(lián)系。LI等[16]在大腸癌齊墩果酸抑制血管生成的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF是Shh和STAT3共同的靶基因，說明兩通路具有共同的作用靶點，具有一定相關(guān)性。SUYAMA等[17]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，CD24可以通過抑制STAT1來下調(diào)Shh的轉(zhuǎn)錄。有研究報道在淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)Shh的活化需要STAT3的激活[18]。YANG等[19]關(guān)于肺腺癌的一項研究也表明STAT3活化可間接上調(diào)Shh基因的表達。本研究結(jié)果也符合相關(guān)趨勢，基于上述證據(jù)，作者推測在宮頸癌中Shh可能是STAT3直接或間接的下游靶基因，下一步將研究兩通路之間影響的具體機制，從而了解它們的調(diào)控流程。

總之，Shh、p-STAT3與宮頸癌/病變緊密相關(guān)，進一步了解宮頸鱗癌產(chǎn)生的分子機制有利于獲得新的治療方案，對早診斷、早干預(yù)及預(yù)后評估均有重要幫助，同時，對研制新靶向藥物有顯著的指導(dǎo)作用。