庫爾勒香梨果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸代謝規(guī)律研究

張 軍,姚 虹

(鄭州工程技術(shù)學(xué)院 a.化工食品學(xué)院；b.分析測試中心，河南 鄭州 450044)

庫爾勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yü. cv. ‘KorlaXiangli’)屬薔薇科、梨屬，新疆梨系統(tǒng)自然雜交品種，有近千年的栽培歷史[1]。庫爾勒香梨果實(shí)具有皮薄肉細(xì)、酥脆多汁、香味濃郁等特點(diǎn)，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。由于其品質(zhì)獨(dú)特，國內(nèi)外市場需要量大，其栽培面積正逐年增大，已經(jīng)成為地理標(biāo)志產(chǎn)品和產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢支柱產(chǎn)業(yè)[2]。近年來，隨著“互聯(lián)網(wǎng)+”等銷售平臺的崛起和物流高速網(wǎng)的建成，新疆優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展勢頭迅猛。因此，研究庫爾勒香梨采前管理、改良果實(shí)品質(zhì)，提升庫爾勒香梨產(chǎn)業(yè)市場競爭力顯得尤為重要。

果實(shí)有機(jī)酸組分與含量是果實(shí)品質(zhì)的重要組成因素，通常有機(jī)酸在果實(shí)生長過程中積累，在成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環(huán)(TCA環(huán))等呼吸基質(zhì)(ATP來源)，以及糖異生作用基質(zhì)而被消耗[3]。因此，有機(jī)酸在果實(shí)發(fā)育過程中是果實(shí)品質(zhì)形成的基礎(chǔ)“物質(zhì)”和代謝“能量”保障。分析有機(jī)酸的變化是研究呼吸和能量代謝途徑變化的重要手段。成熟果實(shí)按照主要有機(jī)酸含量可分成3大類：檸檬酸型果實(shí)、蘋果酸型果實(shí)和酒石酸型果實(shí)[4]。了解果實(shí)類型,研究果實(shí)發(fā)育過程中的有機(jī)酸代謝及其變化規(guī)律,對于提高果實(shí)品質(zhì)具有重要意義，而目前關(guān)于庫爾勒香梨果實(shí)發(fā)育期的有機(jī)酸組分及含量變化的研究鮮有報(bào)道。

本研究分別檢測庫爾勒香梨果實(shí)生長發(fā)育過程中8個(gè)階段的總酸，采用高效液相色譜法(HPLC)鑒定分析乙酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、莽草酸、檸檬酸、抗壞血酸和草酸等10種有機(jī)酸在不同階段的動(dòng)態(tài)變化，旨在為今后庫爾勒香梨果實(shí)品質(zhì)及其風(fēng)味的形成機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為合理的田間管理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試植物材料為新疆庫爾勒沙依東園藝場梨園(北緯41°43′56″東經(jīng)86°1′59″；北緯41°43′17″，東經(jīng)86°2′18″)25年左右樹齡香梨樹(間種授粉樹為碭山梨)，采樣時(shí)間選在12：00～14：00進(jìn)行，選擇生長正常、無病害的庫爾勒香梨植株果實(shí)。每隔30 d左右采樣一次(5月15日、6月16日、7月18日、8月20日，9月16日、10月17日，11月21日、12月20日)，保鮮庫取樣，依次命名為A1，A2…，用冰盒進(jìn)行冰鮮運(yùn)輸，放置于-80 ℃冰箱超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

氫氧化鈉、酚酞、磷酸二氫銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三乙胺、乙酸、氯仿、氯化鈉、石油醚、乙醚、乙醇、無水碳酸鈉、硝酸鋁：均為分析純，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；L-抗壞血酸( Vc)：德國 Dr Ehrenstotfer GmbH 公司；乙腈、甲醇、水：美國Thermo Fisher Scientific公司；正己烷：天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；乙酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、莽草酸、檸檬酸、抗壞血酸和草酸等HPLC標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate?AQ-C18柱(4.6×250mm，5μm)：月旭科技(上海)股份有限公司；10A液相色譜儀(紫外檢測器)：日本島津公司；多樣品定量回旋震蕩濃縮儀：瑞士步琪Buchi 公司；BS210S電子天平：德國Sartorius 公司；冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；HH-2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；SHZ-D( Ⅲ ) 循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；W-HL328超低溫冰箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；GL-4L冷藏保溫箱：廣州佳冷冷藏科技有限公司；移液器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同時(shí)期庫爾勒香梨中總酸測定

參照文獻(xiàn)[5]氫氧化鈉-酚酞法測定總酸含量并作適當(dāng)修改。

1.3.2 不同時(shí)期庫爾勒香梨中有機(jī)酸HPLC法測定

本方法參照文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[7]，結(jié)合月旭科技公司Ultimate?AQ-C18色譜柱說明書并作適當(dāng)修改。

樣品處理：香梨果肉(帶皮)5.0 g，加5 mL流動(dòng)相于冰浴條件下研磨勻漿，用流動(dòng)相定容至10 mL，于50℃超聲提取25 min，冷卻后15000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45濾膜過濾后用于液相色譜。

色譜條件：使用月旭Ultimate?AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-50 mmol·L-1磷酸二氫鈉(pH 2.5)，柱溫26 ℃，流速l mL/min，進(jìn)樣10 μL，紫外檢測器檢測波長為210 nm。

定性分析：將乙酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、莽草酸、檸檬酸、抗壞血酸和草酸10種標(biāo)準(zhǔn)品，各25 mg 分別配制成25 g/L的貯備液，在已優(yōu)化的色譜條件下將以上單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋一定濃度后分別進(jìn)樣，比較每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的保留時(shí)間，若保留時(shí)間相同或很接近，則可證明是同一種物質(zhì)。其余貯備液置于4℃冰箱保存。

定量分析：上述10種貯備液準(zhǔn)確吸取若干，混合稀釋，得5組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，既在已優(yōu)化的色譜條件下，根據(jù)各標(biāo)樣的濃度與峰面積，在LCsolution v1.26化學(xué)工作站中得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析、圖表處理等，使用SPSS 22以及Origin 9.0等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期庫爾勒香梨果實(shí)總酸的變化

梨果實(shí)中有機(jī)酸的含量是果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)的重要指標(biāo)?？偹釡y定時(shí)每次取樣1 mL加19 mL雙蒸水，加1% 酚酞20 uL(試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)酚酞的用量也能影響溶液顯色，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，減少誤差，確定使用酚酞20 uL)。梨、桃、李等果實(shí)中所積累有機(jī)酸以蘋果酸為主[8]，故換算系數(shù)K取0.067。

庫爾勒香梨果實(shí)總酸變化如圖1。坐果1個(gè)月后果實(shí)總酸含量較高，此后香梨總酸含量總體呈下降趨勢，可能由于果實(shí)幼果期代謝旺盛，總酸被消耗而快速下降，其中也有果實(shí)水分增加引起的“稀釋”作用。9月份至貨架期香梨總酸含量下降趨勢平緩，變化不顯著(P<0.05)。

圖1 不同時(shí)期香梨果實(shí)總酸變化

花后1個(gè)月左右(5月中旬)香梨總酸含量為1.3 g/L左右，9月總酸含量降為0.47 g/L，隨后至鮮貯期(12月份)總酸含量從0.43 g/L逐漸降至0.36 g/L，顯示總酸含量下降逐漸平緩，這與前人對梨果實(shí)[9-10]總酸變化趨勢研究結(jié)果基本一致。

2.2 HPLC法檢測香梨果實(shí)有機(jī)酸方法開發(fā)

梨果實(shí)中有機(jī)酸組分和含量是影響其風(fēng)味品質(zhì)形成的重要因素[11]，不同樹種果實(shí)中的有機(jī)酸類型存在較大的差異。使用HPLC對香梨中有機(jī)酸進(jìn)行分析，根據(jù)前人對梨、桃、杏等果實(shí)中已經(jīng)測定的有機(jī)酸種類[12-15]，選擇乙酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、莽草酸、檸檬酸、抗壞血酸和草酸作為研究對象。檢測有機(jī)酸一般采用C18反相柱，為了得到更好的分離檢測效果，本研究選用有機(jī)酸專用色譜柱，能將10種有機(jī)酸中的8種完全分開，如圖2。

圖2 10種有機(jī)酸在HPLC中保留時(shí)間

圖2顯示在混標(biāo)中出現(xiàn)了峰型互相掩蔽的現(xiàn)象，其中富馬酸出峰時(shí)間(RT)9.373 min，由于峰形較小，剛好被蘋果酸的雜質(zhì)峰遮掩(蘋果酸有手性C原子，因此有旋光活性，有可能兩個(gè)峰分別是蘋果酸的D型和L型，一般是蘋果酸D型和L型共存)，故忽略不計(jì)；莽草酸出峰時(shí)間(RT)3.174 min，由于峰形較小，剛好被草酸的峰完全遮掩，故忽略不計(jì)，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)[6]的研究結(jié)果不一致。8種有機(jī)酸RT分別為：草酸3.173、酒石酸3.651、蘋果酸4.819、抗壞血酸5.478、乳酸5.978、乙酸6.472、檸檬酸8.554、琥珀酸10.972。

本試驗(yàn)使用的HPLC檢測器是紫外檢測器，利用紫外吸收原理對物質(zhì)進(jìn)行定性定量。紫外吸收是有機(jī)酸分子中生色團(tuán)的特征，而不是整個(gè)分子的特征[16]，有機(jī)酸因?yàn)楹恤然哂凶贤馕?，預(yù)試驗(yàn)中相同濃度的10種有機(jī)酸紫外吸收強(qiáng)弱差異非常大，草酸(乙二酸)有最強(qiáng)的吸收峰，而檸檬酸吸收峰卻非常低，原因可能是草酸的兩個(gè)羰基在空間上互相排斥，類似于形成了兩頭的傘形，且外圍的羥基也是較強(qiáng)的生色基團(tuán)，顯色的累加效果致使在HPLC的紫外檢測中較低濃度獲得了較明顯的峰型。乙酸只有一個(gè)生色基團(tuán)，濃度很高時(shí)才有明顯峰型；檸檬酸(3-羥基丙三羧酸)可能是中間的羥基有未成對電子與溶劑形成氫鍵，產(chǎn)生n→π*對稱性禁止躍遷，所以吸收峰非常弱[17]。

根據(jù)以上對有機(jī)酸保留值RT的分析，制備混標(biāo)進(jìn)行精密度測定，得出8種有機(jī)酸檢測方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、不確定度等相關(guān)信息，如表1。

表1 8種有機(jī)酸的線性關(guān)系

表1顯示相關(guān)關(guān)系R2都在0.99以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.7～1之間，分布較為合理，說明該檢測方法適用于庫爾勒香梨果實(shí)有機(jī)酸的檢測。

2.3 HPLC法檢測香梨果實(shí)8種有機(jī)酸在不同時(shí)期的變化

用HPLC法檢測有機(jī)酸，檢測器是紫外檢測，原理依然是紫外吸收，既不同的酸生色基團(tuán)不同，產(chǎn)生的紫外吸收效應(yīng)不同。本文中開發(fā)的方法適合有機(jī)酸的分離和檢測。檢測結(jié)果如圖3。

8種有機(jī)酸在庫爾勒香梨果實(shí)不同時(shí)期的含量變化差異明顯，主要有機(jī)酸為蘋果酸、檸檬酸，而李芳芳等[18]認(rèn)為香梨主要以蘋果酸為主，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩者相差不顯著。香梨從花后1個(gè)月左右(5月中旬)至12月中旬有機(jī)酸含量變化如圖4。8種有機(jī)酸中，在5月份蘋果酸含量最高，達(dá)到1.198 g/L，檸檬酸含量為0.476 g/L，酒石酸含量為0.382 g/L。隨著生長發(fā)育的不斷進(jìn)行，有機(jī)酸含量開始下降，第5批樣品(9月份)開始下降較為明顯。

按照果實(shí)中有機(jī)酸含量不同，將水果分為蘋果酸型、檸檬酸型和酒石酸型3種類型。從圖4可以明顯看出，在香梨生長發(fā)育過程中蘋果酸和檸檬酸始終是主要有機(jī)酸類型。由于抗壞血酸分子結(jié)構(gòu)中的烯二醇基，尤其是C3位OH由于受共軛效應(yīng)的影響，酸性較強(qiáng)(pK=4.17)，C2位OH由于形成分子內(nèi)氫鍵，酸性極弱(pK=11.75)，故一般認(rèn)為抗壞血酸為一元酸[19]。由于抗壞血酸在果實(shí)中是高效的抗氧化劑，同時(shí)也是參與各種生化反應(yīng)的輔酶[20]，本試驗(yàn)將其列為研究對象，考證與香氣品質(zhì)的關(guān)系。7月后香梨果實(shí)中有機(jī)酸構(gòu)成發(fā)生了明顯變化，以抗壞血酸為主，占總酸的66.93%，而蘋果酸和檸檬酸總共占30%。

從7月份開始酒石酸(包括乙酸、乳酸等)的含量明顯下降，所占比例減小顯著。分析不同時(shí)期香梨果實(shí)有機(jī)酸含量變化，可知蘋果酸、檸檬酸和抗壞血酸是香梨果實(shí)的主要酸。

圖3 不同時(shí)期香梨果實(shí)有機(jī)酸含量液相色譜圖注：色譜圖中：1-草酸、2-酒石酸、3-蘋果酸、4-抗壞血酸、5-乳酸、6-乙酸、7-檸檬酸、8-琥珀酸；A1～A8表示不同時(shí)期采摘的8個(gè)樣品。

圖4 不同時(shí)期香梨果實(shí)有機(jī)酸含量變化

在前7批次(貨架期，11月中旬左右)樣品中檸檬酸所占比例變大，隨后在第8批次樣品中(貨架期，12月份)蘋果酸和檸檬酸含量所占比例很接近，分別為21.52%和20.04%。香梨果實(shí)中8種有機(jī)酸含量總和呈現(xiàn)先升高再下降的變化趨勢，與測定的總酸含量變化趨勢基本一致。

3 結(jié)論與討論

開發(fā)的HPLC方法可以同時(shí)定性定量乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸、抗壞血酸和草酸等8種有機(jī)酸。庫爾勒香梨果實(shí)在不同階段的有機(jī)酸含量變化差異明顯，在5月份蘋果酸含量最高，達(dá)到1.198 g/L，檸檬酸含量達(dá)到0.476 g/L，酒石酸達(dá)到0.382 g/L。到7月后，庫爾勒香梨果實(shí)中有機(jī)酸構(gòu)成發(fā)生了明顯變化，以抗壞血酸為主，蘋果酸次之。成熟果實(shí)中所積累的主要有機(jī)酸大體分為蘋果酸型、檸檬酸型和酒石酸3大類型，香梨果實(shí)可以劃分為蘋果酸型。

有機(jī)酸作為果實(shí)風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)的重要構(gòu)成因素，影響水果的口感、色澤及生物穩(wěn)定性，同時(shí)還是果品成熟度、耐藏性以及加工性的重要依據(jù)。庫爾勒香梨果實(shí)生長發(fā)育過程中，總酸及其各種有機(jī)酸組分含量變化較大。庫爾勒香梨果實(shí)在發(fā)育前期總酸含量高(1.3 g/L)，9月份后降低的趨勢平緩(從0.43 g/L逐漸降至0.36 g/L)。庫爾勒香梨果實(shí)在花后1個(gè)月至10月份采摘，于常溫下貯藏兩個(gè)月后，總酸變化始終是降低，總酸含量從1.3 g/L降至0.36 g/L。發(fā)育過程中酸含量降低主要是因?yàn)椴糠钟袡C(jī)酸轉(zhuǎn)變成糖，有些則氧化成 CO2和 H2O，或者被堿性物質(zhì)中和，也有在次生代謝的過程中提供大量的羧基，形成酯類代謝物。