QuEChERS結(jié)合GC-MS/MS檢測(cè)鐵皮石斛中5種農(nóng)藥殘留

蔡振輝, 張春柳, 許亦峰, 阮碧媛, 鄭世仲

(1.寧德市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建 寧德 352100；2.寧德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 寧德 352100； 3.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKiumra et Migo)屬蘭科石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)廣西、云南、湖南、浙江等地，以莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津之功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛含有生物堿及多種水溶性多糖、黏液質(zhì)和微量元素，具有極高的藥用價(jià)值和顯著的防衰老及增強(qiáng)免疫力等功效[2]。近年來(lái)，隨著鐵皮石斛栽培面積的不斷擴(kuò)大，蟲(chóng)害發(fā)生率不斷提高，繼而造成農(nóng)藥濫用。當(dāng)前，農(nóng)藥殘留已經(jīng)嚴(yán)重影響鐵皮石斛質(zhì)量并引起廣泛關(guān)注[3]。乙烯菌核利、腐霉利作為常見(jiàn)的殺菌劑廣泛用于鐵皮石斛灰霉病的防治，毒死蜱、聯(lián)苯菊酯和伏殺硫磷常用于鐵皮石斛中斜紋夜蛾、蚜蟲(chóng)等蟲(chóng)害的防治，因而有必要對(duì)鐵皮石斛中乙烯菌核利、腐霉利、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯和伏殺硫磷等5種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)[4-5]。

QuEChERS法是當(dāng)前農(nóng)藥殘留前處理技術(shù)的首選，主要使用乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine, PSA)、石墨炭黑(graphitized carbon black, GCB)、C18等分散劑進(jìn)行凈化分析，相較傳統(tǒng)的固相萃取法具有方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS)以氣相色譜和質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)，綜合了氣相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜技術(shù)精密的測(cè)定能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜化合物的精確測(cè)定[9]。本研究采用GC-MS/MS技術(shù)，并結(jié)合QuEChERS凈化技術(shù)建立一種高效便捷的分析方法，檢測(cè)鐵皮石斛中乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、聯(lián)苯菊酯和伏殺硫磷等農(nóng)藥殘留，以期為鐵皮石斛的農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用鐵皮石斛均采購(gòu)于寧德市蕉城區(qū)赤溪鎮(zhèn)鐵皮石斛種植基地，采購(gòu)時(shí)間為2020年1月下旬。采購(gòu)的12批次鐵皮石斛樣品分別來(lái)自于4個(gè)不同種植戶，每個(gè)種植戶均采購(gòu)3批次。

1.2 儀器與試劑

日本島津GCMS-TQ8040氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，梅特勒PL602E電子天平(梅特勒儀器公司)，超聲清洗儀(KQ-500E，昆山舒美)，F(xiàn)P3010料理機(jī)(德國(guó)Braun公司)，AD500S-H高速均質(zhì)機(jī)(上海昂尼)，Organomation EVAP-111型氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)，Sigma 3-18KS高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，移液器(德國(guó)VITILAB公司)。

乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、聯(lián)苯菊酯和伏殺硫磷標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1，購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測(cè)保護(hù)研究所。PSA、GCB和MgSO4等粉劑及HPLC級(jí)乙腈、正己烷和丙酮等試劑購(gòu)自上海安普公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件 (1)色譜條件。Aglient DB-5 MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；載氣：高純氦氣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；流量控制方式：線速度；進(jìn)樣量：1.0 μL。升溫程序如下：初始溫度50 ℃保持1 min，以25 ℃·min-1的速率升溫至125 ℃，再以10 ℃·min-1的速率升溫至290 ℃。

(2)質(zhì)譜條件：采用EI 離子源，離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；碰撞氣為高純氬氣；溶劑延遲3.0 min；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)檢測(cè)，使用島津軟件系統(tǒng)功能篩選最佳目標(biāo)離子和參考離子。

1.3.2 分散劑優(yōu)化 QuEChERS試驗(yàn)中常用的分散劑有無(wú)水MgSO4、PSA、GCB和C18等，其中MgSO4主要用于去除水分，PSA可用于去除碳水化合物、脂肪酸、酚類(lèi)和少量色素，GCB能夠去除色素、甾醇類(lèi)和非極性干擾物，而C18對(duì)去除脂肪和酯類(lèi)等非極性干擾物效果良好[10]。鑒于鐵皮石斛鮮條基質(zhì)組分多為水溶性，油脂量少，故僅選擇MgSO4、PSA、GCB作為萃取劑進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)L9(3×3)測(cè)試PSA、MgSO4和GCB 對(duì)鐵皮石斛基質(zhì)的凈化效果(表1)，并以5種農(nóng)藥的平均回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)凈化后回收效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 分散劑正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)表1)Table 1 Factors and levels in orthogonal test of dispersants

1.3.3 配置標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液 取乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、聯(lián)苯菊酯和伏殺硫磷標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過(guò)移液管各吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL量瓶中，加丙酮和正己烷混合液定容至刻度，搖勻，配置成10.0 μg·mL-1的中間存儲(chǔ)液。配制質(zhì)量濃度依次為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加丙酮定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。

1.3.4 樣品處理 使用料理機(jī)將鐵皮石斛鮮條充分?jǐn)囁?、混勻，稱(chēng)取10.0 g樣品置于50 mL塑料離心管中，隨后加入20.0 mL乙腈、5.0 g NaCl、1.0 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，使用勻質(zhì)機(jī)充分混合后超聲提取15 min，隨后將離心管置于離心機(jī)中5 000 r·min-1離心3 min。離心完畢后吸取5.0 mL上清液分別加入裝有700 mg MgSO4、100 mg PSA和10 mg GCB的15 mL離心管中，振蕩1 min后5 000 r·min-1離心3 min，準(zhǔn)確吸取2.0 mL上清液于10.0 mL試管中，40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两?。加?.0 mL體積比為1∶1的丙酮與正己烷混合液復(fù)溶，過(guò)微孔濾膜用于測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS/MS質(zhì)譜條件的優(yōu)化

GC-MS/MS包含農(nóng)藥殘留數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)具備質(zhì)譜系統(tǒng)的優(yōu)化功能。對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描獲取了5種農(nóng)藥組分離子碎片和MRM總離子流圖(圖1)。依據(jù)相對(duì)豐度、質(zhì)荷比等因素確定1～3個(gè)離子，并將其作為母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，進(jìn)一步對(duì)離子作用電壓進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳子離子和優(yōu)化電壓。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜優(yōu)化獲得5種農(nóng)藥組分的保留時(shí)間、MRM離子對(duì)及最佳作用電壓，結(jié)果見(jiàn)表2。

A.乙烯菌核利；B.毒死蜱；C.腐霉利；D.聯(lián)苯菊酯；E.伏殺硫磷。圖1 GC-MS/MS中5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 μg·mL-1)的MRM總離子圖Figure 1 The MRM chromatogram of 5 pesticide standard solutions (1.0 μg·mL-1) by GC-MS/MS

表2 農(nóng)藥殘留化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of pesticide residues

2.2 QuEChERS中分散劑的優(yōu)化

表3 3種分散劑組合的正交試驗(yàn)結(jié)果1)Table 3 The results of orthogonal tests for 3 dispersants

MgSO4、PSA和GCB等3種分散劑對(duì)鐵皮石斛的凈化效果見(jiàn)表3。從表3可見(jiàn)，各試驗(yàn)組回收率在56.35%～109.40%之間；各分散劑對(duì)回收率的影響從大到小依次為：PSA>GCB>MgSO4；PSA、MgSO4和GCB的最佳水平分別為1、3和1，即三者的最佳用量分別為100、700、10 mg。

2.3 方法線性范圍、檢出限及定量限分析

確定最佳測(cè)試條件后，配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線上機(jī)測(cè)定，以5種農(nóng)藥組分的峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表4所示，乙烯菌核利、毒死蜱、腐霉利、聯(lián)苯菊酯和伏殺硫磷質(zhì)量濃度在0.05～2.0 μg·mL-1的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999，表明其具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比計(jì)算檢出限(limit of detection, LOD)和以10倍信噪比計(jì)算定量限(limit of quantitation, LOQ)表明，LOD在0.001～0.004 mg·kg-1、LOQ在0.003～0.012 mg·kg-1之間，說(shuō)明該方法具有較好的檢出效果。

表4 5種農(nóng)藥殘留化合物的GC-MS/MS測(cè)定參數(shù)Table 4 GC-MS/MS parameters for 5 pesticide residues

2.4 方法的加標(biāo)回收率與精密度

在空白鐵皮石斛樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后制成含量分別為0.2、0.5、2.0 mg·kg-1的測(cè)試樣品，每種濃度水平設(shè)置6組平行。如表5所示，在3種加標(biāo)水平下，乙烯菌核利等5種農(nóng)藥殘留回收率范圍為79.76%～91.94%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<5%，表明該方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表5 加標(biāo)回收率與精密度的試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 5 Results of recovery and accuracy tests (n=6)

2.5 方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性

稱(chēng)取10.0 g鐵皮石斛樣品6份，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，設(shè)置質(zhì)量濃度為0.5 μg·mL-1的6組平行，按照“1.3.4”樣品制備方法，測(cè)試平行樣品的進(jìn)樣重復(fù)性；另取加標(biāo)溶液1份分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h后進(jìn)樣分析，檢測(cè)樣品的穩(wěn)定性(表6)。結(jié)果顯示，乙烯菌核利等5種農(nóng)藥殘留重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD分別在1.85%～2.24%和2.78%～4.03%之間，二者均小于5%，表明該方法具有較好的重復(fù)性與穩(wěn)定性，可滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表6 重復(fù)性與穩(wěn)定性的試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 6 Results of repeatability and stability tests (n=6)

2.6 鐵皮石斛樣品的測(cè)定

根據(jù)本研究建立的前處理方法及氣質(zhì)聯(lián)用儀條件，對(duì)赤溪鎮(zhèn)12批次鐵皮石斛樣品進(jìn)行乙烯菌核利等5種農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品和未知樣品的檢測(cè)。根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算樣品中乙烯菌核利等5種農(nóng)藥殘留組分的含量表明，12批次鐵皮石斛樣品均未檢出乙烯菌核利等5種農(nóng)藥殘留，典型圖譜見(jiàn)圖2。

A.乙烯菌核利；B.毒死蜱；C.腐霉利；D.聯(lián)苯菊酯；E.伏殺硫磷。圖2 鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液和樣品溶液的典型圖譜Figure 2 Typical spectrum of standard solution, spiked sample solution and sample solution of D.officinale

3 小結(jié)

QuEChERS前處理技術(shù)相較傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)具有簡(jiǎn)單快捷、經(jīng)濟(jì)高效等特點(diǎn)，并廣泛運(yùn)用于植物農(nóng)藥殘留檢測(cè)[11-13]。本研究通過(guò)改善質(zhì)譜條件和不同分散劑比例，建立了QuEChERS結(jié)合GC-MS/MS測(cè)定鐵皮石斛中5種農(nóng)藥殘留的方法，取得了較好的檢測(cè)效果。對(duì)采集的12批次鐵皮石斛樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明參試鐵皮石斛較好地控制了5種常見(jiàn)農(nóng)藥殘留，如需進(jìn)一步了解食用安全性，仍需增加其他農(nóng)藥的檢測(cè)。為保證5種農(nóng)藥殘留具有最佳的分離效果，研究中氣相程序采用較為緩和的升溫模式，使得檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。實(shí)際工作中如需大批量進(jìn)樣，可通過(guò)加快升溫速率或加大載氣流量等方式使組分提前出峰以節(jié)約時(shí)間。