益母縮宮顆粒調(diào)節(jié)藥物流產(chǎn)不全大鼠血管生成調(diào)節(jié)因子的實(shí)驗(yàn)觀察

李品英，毛惠，黃正迎

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 瀘州 646000）

0 引言

藥物流產(chǎn)主要是采用口服米非司酮和米索前列醇來(lái)終止妊娠，無(wú)痛人流術(shù)是在傳統(tǒng)人流手術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合丙泊酚及芬太尼使手術(shù)中的患者痛苦減少[1]。藥物流產(chǎn)因其方法簡(jiǎn)便、價(jià)格低、創(chuàng)傷小，臨床應(yīng)用廣泛，患者接受度高。但部分患者會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)不全，表現(xiàn)為陰道出血時(shí)間延長(zhǎng)，出血量增多，易造成盆腔感染、月經(jīng)紊亂、貧血等并發(fā)癥[2]。減少藥物流產(chǎn)后異常子宮出血是目前臨床上需要不斷摸索且需解決的問(wèn)題。

益母縮宮顆粒為我院院內(nèi)制劑，是由《傅青主女科》生化湯化裁而來(lái)，由當(dāng)歸、川芎、桃仁、炮姜、益母草、枳殼、蒲黃（生）七味中藥組成,，臨床常用于治療產(chǎn)后、人工流產(chǎn)、上環(huán)等術(shù)后引起的陰道不規(guī)則出血。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益母縮宮顆粒能明顯縮短藥物流產(chǎn)后陰道流血時(shí)間、減少流血量、促進(jìn)惡露排出、幫助子宮復(fù)舊等，有效減少藥物流產(chǎn)后相關(guān)并發(fā)癥[3-5]。目前關(guān)于益母縮宮顆粒對(duì)藥物流產(chǎn)后子宮異常出血的作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)依照王曉東[6]造模法建立藥物流產(chǎn)不全大鼠模型，探討益母縮宮顆粒是否通過(guò)調(diào)控血管生成調(diào)節(jié)因子Ang-1、Ang-2、VEGF 的表達(dá)來(lái)減少藥物流產(chǎn)后子宮異常出血，研究益母縮宮顆粒的作用規(guī)律，為本藥的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

SPF 級(jí)別SD 大鼠，選用2 月齡健康雄性SD 大鼠25 只，體重（250±20）g，2 月齡健康雌性SD 大鼠60 只，體重（220±20）g。均由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（川）2018-17。均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK（川）2018-065。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

益母縮宮顆粒（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室，規(guī)格：10g/袋，產(chǎn)品批號(hào)20191119）；米非司酮（華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，規(guī)格：25mg/片，產(chǎn)品批號(hào)432005041）；米索前列醇（華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.2mg/片，產(chǎn)品批號(hào)43200304）；注射用苯巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.1g/瓶，產(chǎn)品批號(hào)190503）；縮宮素注射液(河南輔仁懷慶堂制藥有限公司，規(guī)格：10IU/支，產(chǎn)品批號(hào):21908013)；大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)ELISA 試劑盒(貨號(hào)：ZC-37412，規(guī)格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產(chǎn))，大鼠促血管生成素-1(Ang-1)ELISA 試劑盒(貨號(hào)：ZC-37428，規(guī)格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產(chǎn))，大鼠促血管生成素-2(Ang-2)ELISA 試劑盒(貨號(hào)：ZC-37429，規(guī)格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產(chǎn))。

1.3 主要儀器

計(jì)算機(jī)，型號(hào)，TFT185W80PS，冠捷顯示科技有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，型號(hào)，SpectraMAXPlus384，美谷分子儀器有限公司生產(chǎn)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，型號(hào)，UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司生產(chǎn)；電子恒溫水浴鍋，型號(hào)DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司生產(chǎn)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，型號(hào)，SYQ-DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；移液槍，規(guī)格，1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)；槍頭，規(guī)格，1000μL、200μL、20μL，美國(guó)Axygen 公司生產(chǎn)；EP 管，規(guī)格：1.5mL、0.2mL、100μL，美國(guó)Axygen 公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物劑量設(shè)計(jì)

益母縮宮顆粒，大鼠給藥量為1.562g/kg·d，中劑量組3.125g/kg·d，高劑量組6.25g/kg·d；米非司酮，大鼠服藥劑量為8.3mg/kg，將該藥研磨成細(xì)粉后加入蒸餾水，灌胃前搖勻；米索前列醇，大鼠服藥劑量為100μg/kg，將該藥研磨成細(xì)粉后加入蒸餾水，灌胃前搖勻給藥；以上藥物灌胃時(shí)按體積給藥：1mL/100g；縮宮素注射液，大鼠用藥劑量為0.9U/kg/d。

2.2 造模

選擇SPF 級(jí)成熟雌性大鼠60 只，雄性大鼠25只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)挑選10 只未合籠雌性大鼠作為空白組（E 組）。依照王曉東造模法將剩下的50 只雌性SD 大鼠與25 只雄性SD 大鼠按照2：1 比例于每日18 時(shí)合籠，次日晨8 時(shí)檢查陰栓或陰道涂片，在陰栓或涂片上發(fā)現(xiàn)精子者定為妊娠第一天d1，若未受孕，則雌鼠繼續(xù)保留，待下次合籠受孕。將成功交配大鼠于妊娠d7 灌胃米非司酮(8.3mg/kg，8 時(shí))和米索前列醇(100ug/kg，18 時(shí))，同時(shí)在陰道內(nèi)置入定量消毒棉球一個(gè)，觀察陰道出血情況，d8 清晨8 時(shí)檢查大鼠陰道消毒棉球，見(jiàn)血跡提示造模成功。

本次實(shí)驗(yàn)共造模成功48 只雌鼠，將造模成功SD大鼠隨機(jī)分為5 組，即模型組（D 組10 只）、益母縮宮顆粒低劑量組（A 組10 只）、益母縮宮顆粒中劑量組（B 組9 只）、益母縮宮顆粒高劑量組（C 組9 只）、縮宮素對(duì)照組（F 組10 只）。

益母縮宮顆粒實(shí)驗(yàn)組于妊娠D8 開(kāi)始每日按高、中、低濃度益母縮宮顆粒灌胃，連續(xù)灌胃7 天，每天1 次；模型組及空白組大鼠于妊娠D8 開(kāi)始每日灌喂動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飲用水，連續(xù)灌胃7 天，每天1 次；縮宮素對(duì)照組于妊娠D8 開(kāi)始肌肉注射縮宮素，連續(xù)注射3 天，每天1 次。

2.3 取材

各組大鼠于妊娠D15 早晨8:00 行全身麻醉（注射用苯巴比妥鈉50mg/kg 腹腔注射）。待麻醉滿意后，以大鼠下腹部正中為切口，沿腹白線縱行切開(kāi)2～3 厘米；逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織，鈍性分離肌肉，暴露腹腔，找到腹主動(dòng)脈，迅速取血，離心機(jī)分離血清，將血清存放于-80℃冰箱備用。

2.4 血管生成調(diào)節(jié)因子檢測(cè)

采用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、促血管生成素-1(Ang-1) 和促血管生成素-2(Ang-2)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料用SPSS 23.0 進(jìn)行分析，VEGF、Ang-1 和 Ang-2 數(shù)據(jù)分布呈正態(tài)分布且方差齊，用“”表示，統(tǒng)計(jì)方法使用單因素方差分析，P<0.05 則認(rèn)為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清中ANG-1 濃度的變化

如表1 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中ANG-1 濃度明顯降低，差異極顯著（P<0.01）。與模型組相比，益母縮宮顆粒高劑量組、縮宮素組大鼠血清中ANG-1 濃度升高，差異顯著（P<0.05）；其余各大鼠血清中ANG-1 濃度無(wú)明顯差異，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清中ANG-1 濃度的變化（）

表1 各組大鼠血清中ANG-1 濃度的變化（）

注：模型組與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；其余組與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 各組大鼠血清中ANG-2 濃度的變化

如表2 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中ANG-2 濃度明顯降低，差異極顯著（P<0.01）。與模型組相比，縮宮素組、益母縮宮顆粒高劑量組大鼠血清中ANG-2 濃度升高，差異顯著（P<0.05）；其余各大鼠血清中ANG-2 濃度無(wú)明顯差異，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠血清中ANG-2 濃度的變化（）

表2 各組大鼠血清中ANG-2 濃度的變化（）

注：模型組與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；其余組與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 各組大鼠血清中VEGF 濃度的變化

如表3 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中VEGF濃度明顯降低，差異極顯著（P<0.01）。與模型組相比，縮宮素組、益母縮宮顆粒高劑量組大鼠血清中VEGF 濃度升高，差異顯著（P<0.05）；其余各大鼠血清中VEGF 濃度無(wú)明顯差異，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠血清中VEGF 濃度的變化（）

表3 各組大鼠血清中VEGF 濃度的變化（）

注：模型組與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；其余組與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2（VEGFR2）所構(gòu)成的信號(hào)通路是作用最強(qiáng)的正性調(diào)控血管生成的信號(hào)通路之一，對(duì)血管新生的整個(gè)過(guò)程發(fā)揮了不可替代的調(diào)節(jié)作用[7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是產(chǎn)生VEGF 的主要細(xì)胞。VEGF 的主要功能受體是VEGFR-2，VEGF 通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上VEGFR-2 結(jié)合來(lái)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步對(duì)下游的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路發(fā)揮激活作用，最終促使血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移，修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)新生血管生成，維持血管壁的通透性。

血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)及其受體Tie-2，是另一條新的血管生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在人類血管形成中發(fā)揮著非常重要的作用[8]。Ang(血管生成素)具有調(diào)節(jié)血管穩(wěn)定和血管新生的功能，有Ang-1 和Ang-2 兩個(gè)亞型，Tie-2 是其共同受體。Ang-l 和Tie-2 結(jié)合后促使Tie2 磷酸，Tie2磷酸化的內(nèi)皮細(xì)胞可以吸引血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞等聚集，從而促使內(nèi)皮細(xì)胞形成完整的血管腔壁，促進(jìn)血管形成。還可以通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)等相互作用維持血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[8]。Ang-2 與Tie-2 結(jié)合能競(jìng)爭(zhēng)性拮抗Ang-1 促使Tie-2 磷酸化的作用，抑制血管的穩(wěn)定性，增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF 的敏感性，從而增加VEGF 血管新生作用[9]。

藥物流產(chǎn)后子宮異常出血屬傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“產(chǎn)后惡露不絕”“胞衣殘留”等范圍，中醫(yī)證型以“多虛多瘀”為特點(diǎn)，病機(jī)以“瘀血阻滯”為中心。舊血不去，新血不生，中醫(yī)治療主要以活血化瘀為主。益母縮宮顆粒具有活血化瘀，促進(jìn)宮縮的作用。前期研究證實(shí)益母縮宮顆?？梢源龠M(jìn)藥物流產(chǎn)不全大鼠子宮復(fù)舊，促進(jìn)子宮平滑肌收縮，縮短陰道出血時(shí)間[10]。本研究顯示，益母縮宮顆粒高劑量組能顯著升高模型大鼠血清中VEGF、Ang-1、Ang-2 的含量，其可能通過(guò)此途徑調(diào)節(jié)VEGF、Ang-1、Ang-2 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)子宮內(nèi)膜創(chuàng)面新生血管形成，促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)，從而減少模型大鼠出血時(shí)間及出血量。