適于制備參考菌株用沙門(mén)氏菌的鑒定和特性研究

黃巾凌，孟令緣，盛煥精，崔生輝，閆韶飛，李鳳琴，楊保偉*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100 2 中國(guó)食品藥品檢定研究院 北京102629 3 國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心 北京100022）

沙門(mén)氏菌可引起食物中毒，導(dǎo)致腸胃炎、傷寒及副傷寒，是一類(lèi)重要的食源性致病菌，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有十分重要的意義。目前，抗生素仍然是對(duì)付包括沙門(mén)氏菌在內(nèi)諸多病原菌的首選。然而，隨著抗生素的廣泛使用，沙門(mén)氏菌的耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重，給人類(lèi)和動(dòng)物健康帶來(lái)極大威脅[1-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，大量學(xué)者以及政府部門(mén)對(duì)食源性沙門(mén)氏菌的藥敏性、耐藥菌株攜帶的編碼基因做了廣泛的調(diào)查和監(jiān)測(cè)[4-6]，然而仍缺乏在耐藥基因檢測(cè)中用作參比的標(biāo)準(zhǔn)樣品。為了更好、更快、更精準(zhǔn)地了解介導(dǎo)食源性致病菌攜帶的耐藥基因和相關(guān)耐藥機(jī)制，檢測(cè)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)菌株的使用非常必要。

參考物質(zhì)（Reference material，RM）是一種已經(jīng)確定具有1 個(gè)或多個(gè)特性值的物質(zhì)或材料，各國(guó)管理機(jī)構(gòu)對(duì)參考物質(zhì)的定義和要求表述各有不同。作為高度均勻、良好穩(wěn)定和量值準(zhǔn)確的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，參考物質(zhì)具有復(fù)現(xiàn)、保存和傳遞量值的基本功能。微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是食品類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中特殊的一類(lèi)，我國(guó)微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制起步較晚，能用于檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較少[7-8]。目前已研制出的微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要應(yīng)用于食源性致病菌的鑒定、病毒和轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)[9-10]，而關(guān)于介導(dǎo)相關(guān)耐藥機(jī)制的耐藥基因檢測(cè)用微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，仍處于空白，急需開(kāi)展此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究，以保證食源性致病菌攜帶的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究遵循參考菌株研制規(guī)范，對(duì)前期研究中得到的部分菌株采用多種方法鑒定和研究，以期為參考菌株的制備提供菌株材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 118 株沙門(mén)氏菌分別于2008、2010、2011、2012年和2013年采集自廣東、北京、福建、上海、陜西、河南和四川等地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市的零售食品及醫(yī)院的臨床生物樣品（人糞）。沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Salmonella Typhimurium）LT2、藥敏性測(cè)定用質(zhì)控菌株大腸桿菌 （Escherichia coli）ATCC25922、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC35218 和糞腸球菌 （Enterococcus faecalis）ATCC29212 均為中國(guó)藥品生物制品檢定研究院惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 瓊脂培養(yǎng)基、MHA 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；XLT4 培養(yǎng)基及其添加液，美國(guó)BD 公司。

1.1.3 抗生素 阿莫西林-克拉維酸（Amoxicillin-Clavulanic，AMC）、頭孢曲松（Ceftriaxone，CRO）、萘啶酮酸（Nalidixic acid，NAL）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、頭孢西?。–efoxitin，F(xiàn)OX）、頭孢噻呋（Ceftiofur，TIO）、氨芐西林（Ampicillin，AMP）、四環(huán)素（Tetracycline，TET）、氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、阿米卡星（Amikacin，AMK）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、磺胺異噁唑（Sulfisoxazole，SSS）、卡那霉素（Kanamycin，KAN）、鏈霉素（Streptomycin，STR）、復(fù)方新諾明（Trimethoprim-Sulfamethoxazole，SXT），美國(guó)Sigma 公司。

1.1.4 主要試劑和儀器

1.1.4.1 試劑 Taq DNA 聚合酶、10×PCR buffer（Mg 2+free）、MgCl2、dNTP mixture、DL2000 DNA marker、Loading buffer、Gel red，寶生物工程 （大連）有限公司。

1.1.4.2 儀器與設(shè)備-80 ℃超低溫冰箱 （MDF-3286S），日本SANYO 公司；-40 ℃超低溫冰箱（DW-FL208），中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；4℃冰箱（BCD-205TA），青島海爾股份有限公司；SW-CJ-1CU 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DGX-9023電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；SB4200DT 微量移液槍?zhuān)聡?guó)Effendorf 公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；HH－4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京科偉儀器有限公司；Milli-QSynthesis 超純水機(jī)，德國(guó)Millipore 公司；XS204 百分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；BHW-8C 恒溫加熱器，上海博通股份有限公司；Mycircle 基因擴(kuò)增儀、GELDOCXR 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad 公司；Hema9600 基因擴(kuò)增儀，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；PJ21C-AN 微波爐，美的集團(tuán)；DYY-6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（VITEK 2 COMPACT 60），法國(guó)梅里埃梅里埃公司；AUTO flex 飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS），德國(guó)Bruker 公司。

1.1.5 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序用引物 19 種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)編碼基因PCR 擴(kuò)增和測(cè)序用引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成（表1）。

表1 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序用引物Table 1 Primers for PCR amplification and sequencing

（續(xù)表1）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙門(mén)氏菌鑒定

1.2.1.1 革蘭氏染色 取潔凈載玻片，于玻片中央加一小滴無(wú)菌水。接種環(huán)火焰灼燒滅菌，冷卻后從LB 瓊脂培養(yǎng)基的單菌落上挑取少量沙門(mén)氏菌與玻片上的水滴混勻，涂成直徑10～15 mm 稀薄而均勻的圓形菌膜，自然干燥后將玻片有菌的一面向上，在酒精燈外焰上加熱固定[18]。在涂片上滴加適量草酸銨結(jié)晶紫染色液，初染60 s，水洗；除盡水滴后在涂片上滴加碘液，媒染60 s，水洗，除盡水滴；再在涂片上滴加乙醇，脫色25～30 s，水洗，除盡水滴；在細(xì)菌涂片上滴加番紅染色液，復(fù)染30～60 s，水洗；自然干燥后鏡檢。染色中使用金黃色葡萄球菌 ATCC29213 和大腸桿菌ATCC25922 分別作為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的質(zhì)控菌。

1.2.1.2 VITEK 生化鑒定 VITEK 生化鑒定在國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心完成。鑒定時(shí)將沙門(mén)氏菌接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取新鮮培養(yǎng)的菌落，制備菌懸液，接種VITEK COMPACT 2 菌種鑒定卡。依照操作說(shuō)明書(shū)方法鑒定。

1.2.1.3 MALDI-TOF-MS 鑒定 MALDI-TOFMS 鑒定在國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心完成。將沙門(mén)氏菌接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，挑取新鮮培養(yǎng)的菌落，按照質(zhì)譜鑒定操作說(shuō)明，將待鑒定菌株涂布于MALDI-TOF-MS 靶板上，在靶孔加上HCCA 基質(zhì)（1 μL/孔），待基質(zhì)晾干后，將靶板放入質(zhì)譜儀工作室進(jìn)行鑒定。

1.2.1.4 16S rDNA 基因擴(kuò)增、序列測(cè)定和分析采用煮沸法制備PCR 用DNA 模板[19]。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃，10 min；94 ℃，1 min；退火溫度下1 min；72 ℃，1 min；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR 反應(yīng)的退火溫度因擴(kuò)增基因引物序列組成而定。2 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在凝膠成像系統(tǒng)拍照留存。陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物在低溫條件下送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)BLAST 在線(xiàn)軟件進(jìn)行分析和對(duì)比（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.2.2 藥敏性測(cè)定 采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）[20]推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定15 種抗生素對(duì)沙門(mén)氏菌的最小抑菌濃度 （Minimum Inhibitory Concentrations，MICs），按照CLSI 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果，確定耐藥表型。供試抗生素名稱(chēng)、使用濃度范圍和耐藥折點(diǎn)如表3所示。藥敏性測(cè)定中使用大腸桿菌ATCC25922 和ATCC35218，糞腸球菌ATCC29212 作為質(zhì)控菌株。

表2 抗生素種類(lèi)、使用范圍和耐藥折點(diǎn)Table 2 The category，concentration range and breakpoint of the antibiotic used for susceptibility test

1.2.3 菌株傳代培養(yǎng)及目標(biāo)基因遺傳穩(wěn)定性測(cè)定基于沙門(mén)氏菌的基因型、攜帶的與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)基因的種類(lèi)及耐藥表型等結(jié)果，從118 株沙門(mén)氏菌中挑選出12 株代表性沙門(mén)氏菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，隨機(jī)選擇其1，3，6，9，12，15 代菌株，檢測(cè)其β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)編碼基因的遺傳穩(wěn)定性。具體方法：將凍存管內(nèi)保藏的原代菌株劃線(xiàn)接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，即為1 代菌株；從每個(gè)1 代菌種培養(yǎng)物中隨機(jī)挑取3～5 個(gè)單菌落，分別劃線(xiàn)接種于另一LB 瓊脂培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)從該3～5 個(gè)單菌落中取菌，制做PCR 模板，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，檢測(cè)在傳代過(guò)程中目標(biāo)基因有無(wú)丟失或發(fā)生變異。重復(fù)此步驟傳代至15 代，以檢測(cè)目標(biāo)基因的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Microsoft Office Excel 2010 對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，使用IBM SPSS Statistics 20.0 進(jìn)行多因素方差分析（Duncan 法，P＜0.05）和多元回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 118 株沙門(mén)氏菌在XLT4 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈黑色，具有金屬光澤（圖1a）。革蘭氏染色結(jié)果為粉紅色短桿狀細(xì)胞，革蘭氏陰性（圖1b）。

2.1.2 生化鑒定

2.1.2.1 VITEK COMPACT 2 鑒定 Vitek 鑒定結(jié)果表明118 株菌均為沙門(mén)氏菌，其中44（37.29%）株鑒定結(jié)果為99%可能性，43（36.44%）株為98%可能性，且二者無(wú)顯著性差異（P＞0.05），然而以上2 種可能性的菌株比例顯著（P＜0.05）高于可能性在95%～97%之間的菌株 （31，26.27%）（圖2，表3）。1 株沙門(mén)氏菌被鑒定為腸炎沙門(mén)氏菌，達(dá)到種鑒定水平，其余117 株均達(dá)到屬鑒定水平。

2.1.2.2 MALDI-TOF MS 鑒定 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果表明118 株菌均為沙門(mén)氏菌，全部可鑒定至屬水平（表3），其中1 株菌的鑒定圖譜如圖3所示。

2.1.3 16S rDNA 鑒定 16S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增、測(cè)序和Blast 在線(xiàn)比對(duì)分析結(jié)果表明118 株菌均為沙門(mén)氏菌，可鑒定至屬水平（表3）。118 株沙門(mén)氏菌16S rDNA 序列同源性在98.50%～99.90%之間。

2.2 沙門(mén)氏菌藥敏性

沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑和頭孢噻呋的耐藥最為普遍，耐藥菌株比例間無(wú)顯著性差異（P＞0.05；比例均為100.00%）；對(duì)四環(huán)素和萘啶酮酸等7 種抗生素的耐藥率均在50%以上，然而對(duì)不同抗生素耐藥的菌株比例間存在顯著性差異。耐阿米卡星、慶大霉素和阿莫西林/克拉維酸的菌株比例較低，對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢西丁比較敏感（表4）。

圖1 菌株的生長(zhǎng)形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Growth morphology and Gram staining result of the strain

圖2 VITEK COMPACT 2 生化鑒定結(jié)果（n=118）Fig.2 VITEK COMPACT 2 biochemical identification results （n=118）

圖3 1 株沙門(mén)氏菌MALDI-TOF MS 鑒定圖譜Fig.3 MALDI-TOF MS identification spectrum of one strain of Salmonella isolate

表3 3 種試驗(yàn)鑒定結(jié)果分析Table 3 Analysis of 3 kinds of experimental identification results

2.3 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)基因及其遺傳穩(wěn)定性

2.3.1 沙門(mén)氏菌中與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)基因的檢出率 在118 株沙門(mén)氏菌中共檢出8種與β-內(nèi)酰胺或/和超廣譜β-內(nèi)酰胺（Extended spectrum β-lactams，ESBLs） 類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)的編碼基因，分別為：blaTEM-1、blaTEM-116、blaOXA-1、blaC-TX-M-3、blaCTX-M-55、blaCTX-M-123、blaCTX-M-64和blaCTX-M-15。其中，76（64.41%）株沙門(mén)氏菌攜帶blaTEM-1，攜帶其它基因的菌株及相應(yīng)的檢出率分別為blaCTX-M-55（50.85%）、blaOXA-1（16.10%）、blaCTX-M-3（15.25%）、blaCTX-M-15（1.69%）、blaTEM-116（1.69%）、blaCTX-M-123（0.85%）和blaCTX-M-64（0.85%）。blaTEM-1檢出率最高，顯著高于blaTEM-116、blaOXA-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-55、blaCTX-M-123、blaCTX-M-64和blaCTX-M-15陽(yáng)性菌株的檢出率（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.3.2 blaTEM-1、blaOXA-1和blaCTX-Ms遺傳及表達(dá)穩(wěn)定性 12 株攜帶β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的代表性沙門(mén)氏菌涵蓋愛(ài)丁堡、腸炎、湯普森、舒卜拉、印第安納、烏普薩拉和阿伯尼等7 種血清型，每個(gè)血清型的沙門(mén)氏菌至少攜帶2 種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)編碼基因。菌株傳代、目標(biāo)基因PCR 擴(kuò)增及序列比對(duì)分析結(jié)果表明，傳代過(guò)程中目標(biāo)基因未丟失，未發(fā)生任何基因變異，證明blaTEM-1、blaOXA-1和blaCTX-Ms基因在菌株1～15 代遺傳過(guò)程中可非常穩(wěn)定的存在（圖5）。

3 討論

諸多食品安全風(fēng)險(xiǎn)中，微生物污染已成為全球公認(rèn)的首要威脅，基于這一問(wèn)題，很多國(guó)際組織相繼制定了食品中微生物的限量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)方法[1-3]。在我國(guó)，隨著國(guó)家對(duì)食品安全問(wèn)題的日益重視，食品檢驗(yàn)方法也逐漸趨于標(biāo)準(zhǔn)化，先后制定了GB4789 系列食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[21]。由于食品安全檢驗(yàn)工作的重要性，因此檢驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果需要更加規(guī)范化，而作為檢驗(yàn)標(biāo)尺的參考物質(zhì)則成為聚焦點(diǎn)。此外，我國(guó)食品安全戰(zhàn)略對(duì)微生物鑒定、分型、耐藥和溯源類(lèi)參考物質(zhì)也有著迫切需求[22-23]。

然而，食品微生物類(lèi)參考物質(zhì)目前卻基本停留在由菌種保藏機(jī)構(gòu)提供純菌種的初級(jí)階段，且這些菌種保藏機(jī)構(gòu)均未將食品微生物作為主要收藏對(duì)象，致使與食品監(jiān)督抽驗(yàn)和中毒等相關(guān)的重要微生物資源嚴(yán)重缺失。國(guó)外權(quán)威機(jī)構(gòu)，如：法國(guó)梅里埃公司和歐盟聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，雖已開(kāi)始制備Bioball 微球等定量或定性微生物參考物質(zhì)，然而由于生物安全問(wèn)題，這些參考物質(zhì)在國(guó)際共享過(guò)程中出現(xiàn)許多困難[24-25]。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》（GB 4789.1-2016）[26]中明確要求定期使用陽(yáng)性對(duì)照對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)在《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNAS-CL09-2013）[27]中也明確要求使用微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者質(zhì)控樣品對(duì)微生物檢驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，對(duì)食品中微生物及相關(guān)特性檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)勢(shì)在必行。

表4 沙門(mén)氏菌的藥敏性（n=118）Table 4 Antibiotic susceptibility of Salmonella（n=118）

圖4 8 種基因在沙門(mén)氏菌中的檢出率（n=118）Fig.4 Detection rates of eight genes in Salmonella （n=118）

近幾年，我國(guó)雖在食品、環(huán)境和臨床等領(lǐng)域研發(fā)了多項(xiàng)參考物質(zhì)[28-32]，建立了國(guó)家參考物質(zhì)資源共享平臺(tái)，然而由于微生物自身易受污染、變化快、內(nèi)部代謝機(jī)制復(fù)雜的特點(diǎn)，使得平臺(tái)上適用于食品微生物檢測(cè)的參考物質(zhì)較少。另外，由于微生物為活體物質(zhì)，參考物質(zhì)制備時(shí)必然具有其特殊性，即：均勻性和穩(wěn)定性難控制，制備程序和工藝復(fù)雜，定值和不確定度評(píng)估困難，因此，相對(duì)來(lái)講我國(guó)目前關(guān)于微生物類(lèi)參考物質(zhì)的研究總體較少。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，駱海朋等[9]、瞿洪仁等[10]已研制出阪崎克羅諾桿菌和單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。國(guó)內(nèi)少數(shù)機(jī)構(gòu)也逐步開(kāi)展了帶有食品基質(zhì)的微生物參考品研究，然而由于參考物質(zhì)溯源性不強(qiáng)，不確定度評(píng)價(jià)模式單一等嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致同一樣品的檢測(cè)值參差不齊，無(wú)法為食品檢驗(yàn)數(shù)據(jù)提供技術(shù)保障。

在食源性致病菌的研究中，要對(duì)微生物某一特性進(jìn)行檢測(cè)，其編碼基因往往被作為靶標(biāo)。而用作該靶標(biāo)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)菌株不僅必須攜帶該編碼基因，而且該編碼基因必須在菌株傳代、培養(yǎng)、貯藏和交換過(guò)程能夠穩(wěn)定存在。圍繞這一目標(biāo)，本研究的最終目的是篩選出可用于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗性菌株相關(guān)耐藥機(jī)制檢測(cè)用參考菌株制備的候選菌株，因此對(duì)這些菌株的鑒定、菌株特性及其攜帶相關(guān)基因遺傳穩(wěn)定性的研究極其重要。本試驗(yàn)根據(jù)微生物參考菌株制備要求及相關(guān)流程，首先對(duì)118 株不同來(lái)源的沙門(mén)氏菌采用4 種方法進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)其藥敏性，結(jié)合前期獲得的樣品來(lái)源、采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)，基于脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE） 的基因型和中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）標(biāo)準(zhǔn)菌株編號(hào)等信息，最終篩選出12 株代表性沙門(mén)氏菌作為制備參考菌株的潛在菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，這12 株沙門(mén)氏菌的相關(guān)特性均符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備要求，具有進(jìn)一步制備β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗性菌株相關(guān)耐藥機(jī)制檢測(cè)用參考菌株的條件，完全滿(mǎn)足制備用于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗性編碼基因檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)菌株的可能性。后期，將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥、瓶間菌數(shù)不確定度及貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終形成已定量的即用型活體菌株，獲得國(guó)家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)，用于快檢和臨檢。

圖5 bla 基因的穩(wěn)定遺傳性Fig.5 The stable inheritability of bla genes