乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823全基因組測(cè)序及胞外多糖基因簇分析

李 敏，李偉程，劉亞華，尤利軍，馬 騰，趙 潔，孫志宏

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

乳酸菌廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品，其中一些菌株可以產(chǎn)生胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）。乳酸菌EPS 是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌的一類長(zhǎng)鏈聚合物，根據(jù)其相對(duì)于菌體的位置分為莢膜多糖和黏液多糖[1]。EPS 不僅可以改善發(fā)酵乳制品的質(zhì)構(gòu)特性、流變性和口感，而且具有抑菌性，抗氧化，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2-5]，因此，能夠產(chǎn)生EPS 的乳酸菌在發(fā)酵工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

EPS 合成分為糖核苷酸合成和eps 基因簇合成2 個(gè)階段。糖類經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)生成糖核苷酸。糖核苷酸作為合成EPS 的前體物質(zhì)，在pgmA、galE、galU 等看家基因和eps 基因簇的調(diào)控下完成重復(fù)單元的合成、聚合和輸出[6]。乳酸菌eps 基因簇結(jié)構(gòu)由4 部分組成：糖基轉(zhuǎn)移酶、調(diào)節(jié)域、輸出蛋白和其它功能蛋白，如多糖的修飾[7]等。全基因組測(cè)序有助于深入了解物種的基因組成、分子進(jìn)化以及功能預(yù)測(cè)。Schell 等[8]對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705 全基因組序列的研究表明，該菌株基因組中含有幾段與低聚糖代謝相關(guān)的基因簇。隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，集高通量、快速度、長(zhǎng)讀長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)于一身的第3 代測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)的研究[9]。通過(guò)PacBio SMRT 測(cè)序技術(shù)對(duì)施氏假單胞菌273（Pseudomonas stutzeri 273）和戊糖乳桿菌SLC13（Lactobacillus pentosus SLC13）等進(jìn)行全基因測(cè)序并注釋到eps 基因簇[7，10]，該技術(shù)將為EPS 的深入研究提供支持。

乳酸乳球菌是發(fā)酵乳制品中常用的發(fā)酵劑之一，常被應(yīng)用于奶酪和低溫發(fā)酵乳的生產(chǎn)。目前，對(duì)于乳酸乳球菌EPS 的研究大多集中于乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp.cremoris，L.lactis subsp.cremoris），如乳酸乳球菌乳脂亞種SMQ-461[11]、乳酸乳球菌乳脂亞種NIZO B40[12]、乳酸乳球菌乳脂亞種Ropy352[13]等菌株中都存在的eps 基因簇，而對(duì)于乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis，L.lactis subsp.lactis）的研究較少。前期試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，同時(shí)高產(chǎn)EPS，有開發(fā)成發(fā)酵劑的潛力。為深入研究該菌株的EPS 合成機(jī)制，本研究采用PacBio SMRT 三代測(cè)序技術(shù)對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 進(jìn)行全基因組測(cè)序，解析其EPS 的合成機(jī)制，為該菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

本研究所用菌株乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 分離自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟自然發(fā)酵乳制品嚼口，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌種資源庫(kù)（LABCC）保藏并提供。目前，已報(bào)道完成全基因組完成圖測(cè)序的乳酸乳球菌有40 株，選取11 株由PacBio SMRT RSII 平臺(tái)測(cè)序的乳酸乳球菌乳酸亞種菌株和乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403 為參考菌株，基因組均下載自NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），具體菌株信息如表1所示。

表1 乳酸乳球菌乳酸亞種基因組基本特征比較分析Table 1 General features of several sequenced L.lactis subsp.lactis genomes

1.2 主要試劑、儀器和設(shè)備

M17 液體培養(yǎng)基，英國(guó)OXOID 公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑；基因組DNA 提取試劑盒WizardRGenomic DNA Purification Kit （A1120），美國(guó)Promega 公司。

ND-1000 型超微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Nano Drop 公司；HH-SI-NI 恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；DHP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京一恒科技有限公司；Eppendorf 5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 菌株培養(yǎng)與基因組DNA 的提取

將冷凍干燥保藏的乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 接種于5 mL M17 液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，以2%的接種量接種于5 mL M17液體培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)3 代，以8 000 r/min 離心2 min 收集菌體，并用滅菌后的PBS 緩沖液（8.0 g/L氯化鈉，1.15 g/L 磷酸氫二鈉，0.2 g/L 磷酸二氫鉀）清洗2 遍。采用WizardRGenomic DNA Purification Kit 試劑盒提取菌株基因組DNA，具體操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 全基因組測(cè)序和組裝

提取的基因組DNA 通過(guò)0.6%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)量鑒定。在濃度和純度達(dá)到測(cè)序要求后，采用PacBio SMRT RSII 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 的全基因組序列測(cè)定，構(gòu)建10 kb 左右的大片段文庫(kù)，使用1 個(gè)測(cè)序芯片，共獲得高于250×的高質(zhì)量原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)下機(jī)后，使用SMRTRPortal 中的RS_HGAPAssembly.3 模塊對(duì)菌株的全基因組序列進(jìn)行組裝拼接[14]。

1.5 基因組注釋

采用Prokka[15]軟件對(duì)菌株基因組進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)得到的CDS 位置信息提取氨基酸序列，與蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù) （Cluster of orthologous groups of proteins，COG）、日本京都基因和基因組百科全書 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（Carbohydrate-active enzymes，CAZy）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)同源序列比對(duì)（E 值＜1×10-5），結(jié)合RAST（http：//rast.nmpdr.org/） 網(wǎng)上在線工具完成功能注釋。

1.6 基因組比較分析

基于Prokka 軟件對(duì)菌株基因組進(jìn)行基因預(yù)測(cè)后，采用Roary[16]軟件識(shí)別核心基因，其中以編碼氨基酸相似性大于95%的標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別基因家族。利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用R 軟件（V.3.3.2）比較不同菌株的特有基因（Unique gene，只在1 株菌中存在）并將結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.7 核酸序列登錄號(hào)

乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 基因組序列已提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為CP041759.1-CP041762.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 的基因組特征

采用PacBio SMRT 測(cè)序技術(shù)對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 進(jìn)行全基因組測(cè)序，最終得到4 條序列，長(zhǎng)度范圍為7 734～2 458 520 bp?；蚪M由1 條2 458 520 bp，GC 含量為35.2%的環(huán)狀染色體DNA 和3 個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒pIMAU11823A（127 965 bp，GC 含量為35.7%），pIMAU11823B（24 554 bp，GC 含量為39.5%），pIMAU11823C（7 734 bp，GC 含量為32.7%）組成（圖1）。乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 在基因組大小、GC 含量、tRNA 數(shù)量等方面與其它12 株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株十分相似（表1），符合乳酸乳球菌乳酸亞種基因組的基本特征，表明測(cè)序結(jié)果滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求。

圖1 乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 基因組信息Fig.1 The global view of the genome of L.lactis subsp.lactis IMAU11823

2.2 乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 功能注釋

采用本地BLASTP 的方法對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 進(jìn)行COG 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋。COG 數(shù)據(jù)庫(kù)共注釋到648 個(gè)功能基因（圖2a）。從圖中可以看出，COG 聚類中未知功能（S）、氨基酸運(yùn)輸與代謝（E）、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成（J）以及一般功能預(yù)測(cè)（R）的蛋白占據(jù)較大比例，分別為18.06%，12.35%，10.96%和9.72%，而與胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸（U）和防御機(jī)制（V）相關(guān)的基因僅分別有8 個(gè)（1.23%）和5 個(gè)（0.77%）。此外，有55 個(gè)基因與碳水化合物運(yùn)輸與代謝（G）相關(guān)，其中編碼半乳糖激酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、半乳糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖滲透酶、甘露糖-1-磷酸脫氫酶等基因與糖核苷酸的合成相關(guān)。

圖2 乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 的COG（a）和KEGG（b）功能分類圖Fig.2 COG （a） and KEGG （b） functional classification map of L.lactis subsp.lactis IMAU11823

乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)共有2 110 個(gè)基因得到注釋，可分為6 個(gè)大類的34 個(gè)亞分類（圖2b）。其中與碳水化合物代謝相關(guān)的基因最多為201 個(gè)，這些基因主要參與淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝等，這些代謝途徑的部分中間產(chǎn)物可能會(huì)參與糖核苷酸的形成[17]。

2.3 乳酸乳球菌乳酸亞種基因組的比較分析

為探究13 株乳酸乳球菌乳酸亞種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，運(yùn)用鄰接法構(gòu)建的核心基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3a）。分析結(jié)果表明13 株菌株形成2 個(gè)分支，分離自狼尾草的乳酸乳球菌乳酸亞種G50 為一支，其它12 株食源分離株聚為一大支。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 與乳酸乳球菌乳酸亞種UC08、UC11和UC06 的遺傳距離較近。據(jù)報(bào)道，菌株UC08 和UC11 染色體上具有與EPS 生物合成相關(guān)的基因簇[18]。

進(jìn)一步比較了菌株IMAU11823 與其它12 株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株之間的差異，采用UpsetR 分別對(duì)13 株乳酸乳球菌乳酸亞種基因組中特有的基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，菌株IMAU11823 基因組中特有基因261 個(gè)，其中73.2%為假定蛋白（圖3b）。除此之外，含有編碼莢膜多糖生物合成蛋白、UDP-α-D-葡萄糖、寡糖生物合成蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖轉(zhuǎn)移酶等與EPS 生物合成相關(guān)的基因，表明菌株IMAU11823 具有特殊的多糖合成能力。

圖3 乳酸乳球菌乳酸亞種親緣關(guān)系（a）和UpsetR（b）分析Fig.3 Genome neighbor （a） and UpsetR （b） analysis of L.lactis subsp.lactis strains

2.4 糖代謝相關(guān)基因的分析

以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株IMAU11823 具有較強(qiáng)的碳水化合物代謝能力和EPS 合成潛力，為深入研究其EPS 合成機(jī)理，從基因組層面針對(duì)菌株IMAU11823 的碳水化合物活性酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和糖核苷酸合成途徑進(jìn)行分析。

2.4.1 碳水化合物活性酶分析 乳酸菌可以利用碳水化合物并轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)供其生長(zhǎng)需要，同時(shí)產(chǎn)生一些具有生物應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物，如：EPS。將13 株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株的蛋白序列分別與CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)后獲取注釋信息。13 株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株共注釋到五大類碳水化合物活性酶的基因，主要以糖苷水解酶（Glyside hydrolases，GHs）和糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferases，GTs）的含量最為豐富，分別占所有酶類的52%和34%（圖4）。

圖4 功能相關(guān)基因在不同菌株中的分布及豐度Fig.4 Distribution and abundance of functional related genes in different strains

GHs 在糖類生物合成、細(xì)胞壁代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物過(guò)程中發(fā)揮著獨(dú)特的作用[19]。Sun 等[20]基于213 株乳桿菌屬模式菌株的比較基因組學(xué)研究表明，目前已發(fā)現(xiàn)的所有乳桿菌基因組中，共有48 種GHs 的編碼基因。本研究中，13 株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株共有GHs 基因21 種，菌株IMAU11823 含有17 種，說(shuō)明該菌株中GHs 的種類豐富，其中GH1 和GH13 的數(shù)量最多，分別為7和8 個(gè)（圖4），這可能是由于其在營(yíng)養(yǎng)豐富的乳環(huán)境中長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果。GH1 主要編碼與乳糖和半乳糖代謝相關(guān)的β-葡萄糖苷酶[21]，GH13 是糖苷水解酶中最大的序列家族，主要編碼與淀粉代謝相關(guān)的α-葡萄糖苷酶[22]，而α/β-葡萄糖苷酶能夠通過(guò)水解葡萄糖苷鍵產(chǎn)生單糖，為EPS 的生物合成提供前體物質(zhì)。因此，菌株IMAU11823 基因組中豐富的糖苷水解酶能夠有效利用代謝不同的碳源，從而為糖核苷酸的形成提供基礎(chǔ)。

GTs 可以催化生命活動(dòng)中低聚糖、多糖等多種糖軛合物的形成，也可以催化合成具有重要的生物學(xué)意義的碳水化合物[23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)菌株IMAU11823 中具有多種編碼GTs 的基因，以GT2 和GT4 的數(shù)量最為豐富，分別為14 個(gè)和4 個(gè)（圖4）。GT2 和GT4 酶類與蔗糖等二糖以及脂多糖、纖維素、殼聚糖的合成相關(guān)，在發(fā)酵乳中這些物質(zhì)尤其是多糖類化合物可能與發(fā)酵乳最終的黏度、持水性等品質(zhì)相關(guān)[14]。菌株IMAU11823 富含GT2 和GT4 說(shuō)明其有較高的糖合成能力，具有合成EPS 的潛力。

2.4.2 糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系（Phosphoenolpyruvate-phosphotransferase system，PEP-PTS）是糖類物質(zhì)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式?；赗AST 注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)菌株IMAU11823 中參與糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因 （表2），結(jié)果顯示，菌株IMAU11823 基因組中不僅含有能量耦合蛋白酶EI，還含有PTS 乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基EII、PTS 纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基EII、PTS 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基EII、PTS果糖轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基EII 和PTS 甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基EII 等10 個(gè)糖特異性通透酶的基因，其中PTS 乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基EII 位于質(zhì)粒pIMAU11823A，其余均位于染色體上。同時(shí)含有乳糖和半乳糖滲透酶。因此，從基因組分析，菌株IMAU11823 可以利用乳糖、纖維二糖、蔗糖、果糖、甘露糖和半乳糖。

表2 乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 的PTS 相關(guān)基因Table 2 Putative genes related to phosphotransferase system （PTS） in L.lactis subsp.lactis IMAU11823

2.4.3 糖核苷酸的合成途徑 根據(jù)基因組信息將菌株IMAU11823 可能利用的糖結(jié)合KEGG 代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)IMAU11823 糖核苷酸的合成途徑，如圖5所示。蔗糖、果糖、纖維二糖、甘露糖由PEP-PTS 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)從胞外進(jìn)入胞內(nèi)，磷酸化后分別產(chǎn)生蔗糖-6-磷酸、果糖-1-磷酸、纖維二糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸，在相關(guān)酶的作用下生成果糖-6-磷酸或葡萄糖-6-磷酸，這2 種產(chǎn)物在葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的作用下相互轉(zhuǎn)換，最終參與UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-N-乙酰甘露糖胺、dTDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖和dTDP-鼠李糖的生物合成。

菌株IMAU11823 可以通過(guò)PEP-PTS 和滲透酶2 種途徑利用乳糖，乳糖-6-磷酸和乳糖分別在6-磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的作用下水解成葡萄糖/半乳糖-6-磷酸和乳糖/葡萄糖。水解產(chǎn)生的半乳糖以及通過(guò)滲透酶進(jìn)入胞內(nèi)的半乳糖通過(guò)UDP-半乳糖途徑生成UDP-半乳糖和Leloir 途徑生成葡萄糖-1-磷酸[24]；葡萄糖在葡萄糖激酶的催化下，生成葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-1-磷酸是糖核苷酸（dTDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖和dTDP-鼠李糖）的中間產(chǎn)物，參與EPS 的生物合成，并且在磷酸葡萄糖變位酶的作用下完成兩者之間的轉(zhuǎn)化。葡萄糖-1-磷酸分別通過(guò)UDP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶合成UDP-葡萄糖和dTDP-葡萄糖，或者在多種dTDP-鼠李糖合成酶的協(xié)助下合成dTDP-鼠李糖。值得注意的是，UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖可以在UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶的作用下相互轉(zhuǎn)化。因此，從基因組分析，菌株IMAU11823 可以合成UDP-葡萄糖、dTDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、dTDP-鼠李糖、UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺和UDP-N-乙酰甘露糖胺7 種糖核苷酸。這些糖核苷酸在eps基因簇的調(diào)控下完成EPS 重復(fù)單元的組裝、聚合和輸出。

2.5 胞外多糖生物合成基因簇的鑒定

乳酸菌EPS 的生物合成是由位于染色體或質(zhì)粒的eps 基因簇調(diào)控和決定的[24]。結(jié)合基因注釋和BLASTP 比對(duì)結(jié)果，乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 染色體上存在一條完整的eps 基因簇，全長(zhǎng)16 kb，由20 個(gè)開放閱讀框（ORF）組成（圖6）。在eps 基因簇上游包含3 個(gè)假定蛋白（Hypothetical protein）和3 個(gè)轉(zhuǎn)座酶（Transposase）的基因，可能參與DNA 的重組和移動(dòng)[11]。與其它乳酸乳球菌類似，epsRXCDB 是位于菌株IMAU11823 eps 基因簇起始處的保守基因，參與EPS 生物合成的調(diào)節(jié)和重復(fù)單元組成[18]。EPS 生物合成開始于具有調(diào)節(jié)功能的基因epsR，該基因僅存在于乳酸乳球菌的eps 基因簇中，說(shuō)明與其它乳酸菌相比乳酸乳球菌具有獨(dú)特的EPS 生物合成的調(diào)節(jié)方式或機(jī)制[25]。epsX 廣泛存在于乳酸乳球菌的eps基因簇中，可能具有膜錨定的作用，然而目前沒(méi)有通過(guò)試驗(yàn)得到證實(shí)；epsBC 與乳酸乳球菌中Eps-BC 具有97%以上的氨基酸同源性，其預(yù)測(cè)的蛋白主要負(fù)責(zé)EPS 鏈長(zhǎng)測(cè)定[11]。根據(jù)CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)分類，乳酸乳球菌eps 基因簇中糖基轉(zhuǎn)移酶的基因三分之一屬于GT2，三分之一屬于GT4，剩余部分屬于其它分類[18]，這與乳酸乳球菌菌株中GT2 和GT4 的數(shù)量最為豐富密切相關(guān)。

圖5 乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 糖核苷酸的合成Fig.5 Synthesis of sugar nucleotides in L.lactis subsp.lactis IMAU11823

圖6 乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 的eps 基因簇Fig.6 Exopolysaccharides gene cluster in L.lactis subsp.lactis IMAU11823

編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因位于eps 基因簇的中間區(qū)域，主要負(fù)責(zé)將單糖轉(zhuǎn)移到多糖鏈上，從而完成重復(fù)單元的合成，然而對(duì)重復(fù)單元中形成主鏈和側(cè)鏈的供體和受體單糖分子具有多重特異性[13]。菌株IMAU11823 的eps 基因簇中心區(qū)域?yàn)榫幋a不同糖基轉(zhuǎn)移酶的基因 （epsDEFJ，GTF1 和GTF2）。epsD 和epsE 編碼引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將糖核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到脂載體上，是催化EPS 生物合成的第1 步。epsD 可將UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到脂載體，該基因介導(dǎo)的自調(diào)節(jié)可能是乳酸乳球菌中控制合成EPS 的一個(gè)普遍特征[26]；epsE 可將構(gòu)成側(cè)鏈的磷酸化半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)到構(gòu)成主鏈的半乳糖殘基上，同時(shí)與EPS 的產(chǎn)量密切相關(guān)[12，27]。epsFJ、GTF1和GTF2 這些編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)Q定EPS重復(fù)單元的生物合成起到關(guān)鍵作用。乳酸乳球菌乳脂亞種SMQ-461 的eps 基因簇中epsEF 共同作用將第2 和第3 個(gè)葡萄糖單元連接到脂載體連接的糖核苷酸上，形成三糖[11]。Wu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)eps 基因簇中缺失編碼引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，菌株將完全喪失合成胞外多糖的能力；而缺失部分編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因仍可產(chǎn)生不同分子質(zhì)量的胞外多糖，說(shuō)明eps 基因簇中含有多個(gè)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因時(shí)，對(duì)于糖苷鍵的形成具有互補(bǔ)作用。

基于氨基酸序列一致性分析，epsH 和epsK為編碼參與EPS 重復(fù)單元的聚合基因。Dabour等[11]對(duì)epsH 的疏水性分析表明，該基因具有9 或10 個(gè)假定的跨膜片段，可能為多糖生物合成相關(guān)的聚合酶。epsM 位于基因簇的末端，編碼1 種膜蛋白，參與EPS 重復(fù)單元的輸出，與乳酸乳球菌乳脂亞種SMQ-461 的eps 基因簇中epsM 以及乳酸乳球菌中編碼寡糖翻轉(zhuǎn)酶的基因具有較高的氨基酸一致性，分別為99.59%和98.54%。

3 結(jié)論

采用PacBio SMRT 三代測(cè)序技術(shù)對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 進(jìn)行全基因組測(cè)序，基因組包括，1 條染色體DNA 和3 個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒。對(duì)菌株IMAU11823 和12 株乳酸乳球菌乳酸亞種進(jìn)行比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 含有261 個(gè)特有基因，其中包括5 種與EPS 生物合成相關(guān)的基因。通過(guò)CAZy 分析發(fā)現(xiàn)該菌含有數(shù)量豐富的糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶，分別占所有酶類的52%和34%，其中數(shù)量最多的GH1、GH13 和GT2、GT4 分別與糖核苷酸以及多糖合成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌株基因組內(nèi)具有乳糖、纖維二糖、蔗糖、果糖、甘露糖和半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及7 種糖核苷酸合成相關(guān)的基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)含有1 個(gè)eps 基因簇主要分為：調(diào)控因子（epsR）、鏈長(zhǎng)決定 （epsBC）、重復(fù)單元的生物合成（epsDEFJ 和GTF1，GTF2）、聚合（epsHK）和輸出（epsM）。本研究的相關(guān)結(jié)果將為乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU11823 所產(chǎn)胞外多糖的結(jié)構(gòu)解析提供幫助，同時(shí)為該菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。