植物乳桿菌對發(fā)酵香腸蛋白質(zhì)分解及游離氨基酸的影響

郭文瑞，韓云飛，楊 揚(yáng)，張艷妮，楊 樂，段 艷*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 呼和浩特010018）

發(fā)酵香腸是指將肉絞碎、脂肪切塊同輔料一起混合后灌入腸衣內(nèi)，經(jīng)微生物發(fā)酵、干燥成熟而制成的有較長貯藏期，并具有典型風(fēng)味的發(fā)酵肉制品[1-2]。蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪是肉制品的三大營養(yǎng)素，可被在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類及內(nèi)源酶分解，從而產(chǎn)生大量風(fēng)味活性物質(zhì)。發(fā)酵香腸的典型風(fēng)味物質(zhì)分為揮發(fā)性（如醇、酮、醛、呋喃）和非揮發(fā)性（如氨基酸、肽、糖、核苷酸）2 類。蛋白質(zhì)在相關(guān)酶（如組織蛋白酶、鈣蛋白酶）的作用下分解為多肽，多肽再通過相應(yīng)的肽酶及氨肽酶分解生成小肽及氨基酸[3-4]，部分生成化合物還可通過Strecker 降解和美拉德反應(yīng)生成醛、酮等物質(zhì)[5]，直接或者間接影響發(fā)酵肉制品的風(fēng)味，因此蛋白質(zhì)分解程度對發(fā)酵香腸的品質(zhì)至關(guān)重要。通過篩選蛋白分解能力較強(qiáng)的發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵香腸，進(jìn)而促進(jìn)其風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，市場上使用較多的發(fā)酵劑之一——乳酸菌具有很強(qiáng)的蛋白分解能力，特別是乳桿菌[6-7]。本研究擬從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中篩選出蛋白分解能力較強(qiáng)的植物乳桿菌（X19-2D）應(yīng)用于羊肉發(fā)酵香腸，以漢森發(fā)酵劑和自然發(fā)酵為對照，探究X19-2D 在羊肉發(fā)酵香腸中的蛋白質(zhì)分解能力及對游離氨基酸產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原輔料：蘇尼特羊后腿肉及羊尾肥膘、豬腸衣、蔗糖、食鹽、黑胡椒粉、孜然粉等，內(nèi)蒙古呼和浩特市售；抗壞血酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鹽，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

發(fā)酵劑：植物乳桿菌（Lactobacilles plantarum）X19-2D，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品實(shí)驗(yàn)室保藏；漢森發(fā)酵劑：木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

試劑：磺基水楊酸，南京化學(xué)試劑股份有限公司；正己烷（色譜純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氧化鎂、異丙醇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8400 全自動凱氏定氮儀，上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司；HDM-3000C 半微量定氮儀，金壇市榮華儀器制造有限公司；L-8900 全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；FSH-2 可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州國華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵劑的活化與制備 將植物乳桿菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基在37 ℃培育24 h，活化3 次后，于4 ℃下6 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌3 次后重懸，菌懸液保留備用。

1.3.2 發(fā)酵香腸的制備

1）基本配方 精選內(nèi)蒙古市售蘇尼特羊后腿肉80%，去筋；羊尾肥膘20%。輔料主要為蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、食鹽2.5%、黑胡椒粉0.5%、亞硝酸鈉70 mg/kg、硝酸鈉100 mg/kg、孜然粉0.5%。

2）制備流程

分組：漢森組（添加漢森商業(yè)發(fā)酵劑，25 g/200 kg）；X19-2D 組 （添加植物乳酸菌X19-2D，107CFU/g）；自然組（未添加發(fā)酵劑）。

3）樣品采集 分別于羊肉發(fā)酵香腸加工過程中3 d（發(fā)酵結(jié)束），11 d（加工結(jié)束），貯藏（4 ℃真空包裝）30，60，90 d，共5 個時間點(diǎn)隨機(jī)抽取樣品，用于后續(xù)指標(biāo)的測定。

1.3.3 氨基態(tài)氮的測定 參照孫夢等[8]的測定方法。取4 g 樣品，加入40 mL 蒸餾水，振蕩30 min，過濾。取濾液20 mL，加入60 mL 蒸餾水，再用氫氧化鈉溶液滴定至pH 8.2，向其加入10 mL 甲醛溶液，調(diào)pH 值至9.2，記錄滴定體積V1。取80 mL蒸餾水做空白試驗(yàn)，記錄滴定氫氧化鈉體積V0。

式中，V1——樣品消耗氫氧化鈉體積（mL）；V0——空白組消耗氫氧化鈉體積（mL）；C——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 （mol/L）；V——吸取樣品稀釋液的體積（mL）。

1.3.4 游離氨基酸的測定 參照陶正清等[9]的測定方法。取4 g 香腸切碎并研磨，加入20 mL 質(zhì)量濃度為5 g/100 mL 的磺基水楊酸溶液，用高速分散器均質(zhì)（6 000 r/min，30 s，3 次），10 000 r/min（4℃） 離心15 min；取2 mL 上清液加入2 mL 正己烷，振蕩，靜止待分層后取非有機(jī)相，用三蒸水以1∶4 的體積比稀釋，然后用0.22 μm 水相濾膜過濾，用L-8900 全氨基酸自動分析儀檢測。

儀器條件：分析柱：4.6 mm×60 mm；樹脂：2622#；柱溫：57 ℃；反應(yīng)柱溫：135 ℃；緩沖液：檸檬酸、檸檬酸鈉緩沖液；顯色液：茚三酮溶液。

1.3.5 總蛋白的測定 根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5-2016） 中的第一法凱氏定氮法進(jìn)行測定[10]。

1.3.6 TVB-N 的測定 根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》（GB 5009.228-2016）中的第一法半微量定氮儀法進(jìn)行測定[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個樣品均做3 次平行測定，采用SPSS Statistics 18.0 軟件做顯著性分析，差異顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01；采用Excel 2010 做其它數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基態(tài)氮含量變化

蛋白質(zhì)、多肽等含氮化合物在加工及貯藏過程中會逐漸降解，生成小肽、游離氨基酸等物質(zhì)，氨基態(tài)氮的測定通過檢測產(chǎn)品中羧基的含量反應(yīng)蛋白分解情況[12]。如圖1所示，在3～11 d，3 組香腸氨基態(tài)氮含量均顯著升高（P＜0.05），成熟期間微生物產(chǎn)生的蛋白水解酶對蛋白有分解作用[13]，促進(jìn)氨基酸及小肽的產(chǎn)生，與Wu 等[14]的研究結(jié)果一致。發(fā)酵11 d，X19-2D 的氨基態(tài)氮含量為0.62 g/100 mL 顯著高于其它2 組（P＜0.05）。發(fā)酵香腸成品貯藏條件為4 ℃，蛋白酶與微生物酶的活性不高，因而導(dǎo)致在貯藏期間各組氨基態(tài)氮含量變化不顯著（P＞0.05）[15]。貯藏90 d 時，X19-2D 組和漢森組的氨基態(tài)氮含量顯著高于自然發(fā)酵組 （P＜0.05）。此外，據(jù)Almeida 等[2]報道乳酸菌產(chǎn)生的外源酶有助于蛋白分解。結(jié)果表明，X19-2D 對氨基態(tài)氮的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，從而證明其蛋白分解能力較強(qiáng)。

2.2 游離氨基酸含量變化

2.2.1 總游離氨基酸含量變化 游離氨基酸是風(fēng)味活性化合物，由蛋白質(zhì)、多肽等在內(nèi)源酶及乳酸菌產(chǎn)生的外源酶的作用下分解產(chǎn)生，可作為衡量蛋白質(zhì)降解程度的指標(biāo)[16-17]。如圖2所示，0～3 d 各組香腸總游離氨基酸含量均降低，在發(fā)酵過程中，溫度在24～25 ℃之間，游離氨基酸遇熱降解可與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。在發(fā)酵3 d 后，總游離氨基酸的含量呈上升趨勢，在發(fā)酵3～11 d，總游離氨基酸含量增加速率最快，11 d 后上升緩慢，氨基態(tài)氮和游離氨基酸測定結(jié)果相關(guān)性很高，均可作為判斷蛋白分解程度的指標(biāo)。在成熟期（3～11 d）水分逐漸降低，溫度較低（14～15 ℃）可降低美拉德反應(yīng)，蛋白分解的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于美拉德反應(yīng)速率，促進(jìn)FAA 的積累[18]。在貯藏過程中總游離氨基酸含量均為X19-2D 組最高。貯藏90 d，X19-2D 組與漢森組的總游離氨基酸含量差異達(dá)到最大值，高達(dá)300 mg/100 g?？梢姡哂械鞍追纸庾饔玫娜樗峋鶻19-2D 促進(jìn)了游離氨基酸的產(chǎn)生。

圖1 各組發(fā)酵香腸氨基態(tài)氮的變化Fig.1 Changes of amino nitrogen content in each group of fermented sausages

圖2 各組發(fā)酵香腸總游離氨基酸含量變化Fig.2 Changes of total free amino acids content in each group of fermented sausages

2.2.2 呈味游離氨基酸含量變化 3 組香腸均檢測出17 種游離氨基酸，其中Glu 與Ala 含量最高，與Ju 等[19]發(fā)酵香腸的研究結(jié)果一致。發(fā)酵0～3 d，多數(shù)氨基酸含量下降；發(fā)酵3～11 d，各氨基酸含量增長較快，與吳燕燕等[20]的研究結(jié)論一致。在貯藏期間，除Cys、Lys、His 和Arg 以外，其它氨基酸均呈增長趨勢，說明多肽在氨基酸酶的作用下不斷降解。0～3 d，3 組發(fā)酵香腸的Thr 均顯示未檢測出，第11 天X19-2D 組Thr 的含量為40.513 mg/100 g，而其它2 組仍未檢測出。貯藏1 個月，X19-2D 組的Cys 含量為9.896 mg/100 g，漢森組和自然組的Cys 含量過低，且貯藏60 d 漢森組的Cys含量依舊未檢測出。結(jié)果表明，X19-2D 可促進(jìn)氨基酸的產(chǎn)生，加速羊肉發(fā)酵香腸的蛋白質(zhì)分解。

檢測出的游離氨基酸中Asp 與Glu 具有鮮味，Ser、Gly、Thr、Ala 與Pro 具有甜味，Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 具有苦味[21]。在加工及貯藏過程中，X19-2D 組的氨基酸Ser、Gly、Thr、Ala、Asp、Val、Met、Ile、Leu、Phe 均高于其它2 組，其中Asp 具有鮮味，Ser、Thr、Gly、Ala 具有甜味。呈現(xiàn)苦味的His 在加工結(jié)束及貯藏過程中均低于其它2 組。由圖3～圖5可知，3～11 d，呈現(xiàn)鮮味、甜味、苦味氨基酸含量提高速度最快，在11 d 之后，各呈味氨基酸含量上升緩慢，說明成熟期間產(chǎn)生的呈味氨基酸積累量決定了發(fā)酵香腸的滋味[12]，且3 組呈味氨基酸含量極顯著相關(guān) （P＜0.01），說明其變化趨勢一致。X19-2D 組呈現(xiàn)甜味、鮮味的氨基酸總量高于其它2 組，呈現(xiàn)苦味的氨基酸略高于其它2 組。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)苦味的氨基酸過高會影響香腸的品質(zhì)，然而同時，許多苦味氨基酸也具有增加呈味復(fù)雜性，提高鮮度的作用[22-23]。部分引起苦味的氨基酸可作為極具影響香腸風(fēng)味的前體，如Leu、Val 等，在相應(yīng)轉(zhuǎn)氨酶及脫羧酶存在的條件下，生成2-甲基丁醛和3-甲基丁醛及3-甲基丁醇，且3-甲基丁醛與硫化合物反應(yīng)可產(chǎn)生類似培根香味的物質(zhì)[24]。結(jié)果證明，X19-2D 可促進(jìn)呈味氨基酸的釋放，可改善發(fā)酵香腸的風(fēng)味。

2.2.3 必需氨基酸組成評價的變化 食品中蛋白質(zhì)量不僅要求必需氨基酸的種類齊全，并且氨基酸模式與人體蛋白質(zhì)氨基酸模式越接近，則營養(yǎng)價值越高。各組香腸必需氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（WHO/FAO）模式譜對比結(jié)果如表1所示，其中各組香腸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是Leu，達(dá)到10%以上，在推薦值的1.7 倍以上。其次較高的是Tyr 和Phe 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)酵11 d 時，是推薦值的2 倍，逐漸降低接近推薦值，貯藏90 d，X19-2D 組的Tyr 和Phe 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為推薦值的1.3 倍，與其它2 組相比最接近推薦值。漢森組Ile 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于推薦值，X19-2D 組的Ile 質(zhì)量分?jǐn)?shù)是推薦值的1～1.1 倍。X19-2D 組的Leu 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵11 d 和貯藏30 d 后均低于推薦值，之后是推薦值的1.1～1.4 倍。X19-2D 組的Met 和Cys 與Thr 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，在推薦值之上。隨著貯藏時間延長，Tyr 和Phe 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越接近推薦值。X19-2D 組的Val 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在11 d 時達(dá)到最大值8.3%，之后逐漸降低到推薦值的1.3 倍，而其它2 組在貯藏30 d 之后呈上升趨勢。綜合分析，X19-2D 組發(fā)酵香腸的氨基酸模式更接近WHO/FAO 模式推薦值。

圖3 各組發(fā)酵香腸呈甜味氨基酸含量的變化Fig.3 Changes of sweet amino acids content in each group of fermented sausages

圖4 各組發(fā)酵香腸呈鮮味氨基酸含量的變化Fig.4 Changes of fresh amino acids content in each group of fermented sausages

圖5 各組發(fā)酵香腸呈苦味氨基酸含量的變化Fig.5 Changes of bitter amino acids content in each group of fermented sausages

表1 各組發(fā)酵香腸人體必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與WHO/FAO 模式譜比較Table 1 Comparison of the total amino acid content of essential amino acids in each group of fermented sausages and the WHO/FAO model spectrum

（續(xù)表1）

2.3 蛋白質(zhì)的變化

3 組發(fā)酵香腸的蛋白質(zhì)含量的變化如圖6所示，在3～11 d，各組香腸蛋白質(zhì)含量顯著上升（P＜0.05），主要原因是在溫度為14～15 ℃，濕度為90%～65%的條件下干燥，水分活度降低到0.88 以下，致使干物質(zhì)的含量顯著上升，與劉夏煒[25]的研究結(jié)果一致。在貯藏過程中，各組發(fā)酵香腸蛋白質(zhì)含量變化不顯著（P＞0.05），均保持在32～36 g/100 g 之間，在貯藏的過程中，由于水分及溫度較低，致使蛋白水解酶的活性受到抑制，因而蛋白質(zhì)分解程度不明顯?？芍参锶闂U菌X19-2D 對發(fā)酵香腸的蛋白含量無顯著影響。

圖6 各組發(fā)酵香腸的蛋白含量的變化Fig.6 Changes of protein content in each group of fermented sausages

2.4 TVB-N 含量的變化

TVB-N 含量反映含氮化合物的降解情況，在內(nèi)源酶及微生物的作用下，含氮化合物會降解產(chǎn)生具有揮發(fā)性的堿性物質(zhì)，產(chǎn)生腐敗的胺臭味，是表示肉制品新鮮度的指標(biāo)[26]。由圖7所示，3 組香腸的TVB-N 含量雖有波動，然而整體呈上升趨勢，說明在微生物和酶的作用下，不斷的產(chǎn)生大量腐敗臭味的代謝產(chǎn)物，使TVB-N 含量持續(xù)增高[27]。在3～11 d，X19-2D 組的TVB-N 含量顯著下降（P＜0.05），其它2 組顯著上升（P＜0.05）；在貯藏60～90 d，X19-2D 組的TVB-N 含量顯著下降，其它2 組變化不顯著（P＞0.05）。根據(jù)許女等[28]報道，接種了植物乳桿菌CP3 處理組香腸的TVB-N 含量顯著低于對照組。說明植物乳桿菌X19-2D 在一定程度上可以控制TVB-N 的產(chǎn)生，提高發(fā)酵香腸的安全性。

圖7 各組發(fā)酵香腸TVB-N 含量的變化Fig.7 Changes of TVB-N content in each group of fermented sausages

3 結(jié)論

本研究在內(nèi)蒙古傳統(tǒng)肉制品中篩選蛋白分解能力較強(qiáng)的植物乳桿菌X19-2D 為發(fā)酵劑應(yīng)用于羊肉發(fā)酵香腸，同時以商業(yè)漢森發(fā)酵劑和自然發(fā)酵為對照，探究X19-2D 對羊肉發(fā)酵香腸蛋白降解及游離氨基酸產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，X19-2D對氨基態(tài)氮的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，在貯藏期間，X19-2D 組的總游離氨基酸含量、呈味氨基酸含量均高于其它2 組，必需氨基酸模式比其它2 組更接近營養(yǎng)推薦值，氨基態(tài)氮含量和總游離氨基酸含量測定結(jié)果一致，在3～11 d，含量明顯增加，在貯藏期間，增長緩慢，說明成熟干燥期間是發(fā)酵香腸蛋白分解的主要階段。3 組蛋白含量無顯著差異 （P＞0.05）。在11 d 和貯藏90 d，X19-2D 組TVB-N 含量顯著低于其它2 組（P＜0.05）。研究表明，植物乳桿菌X19-2D 組可促進(jìn)羊肉發(fā)酵香腸的蛋白降解，從而增強(qiáng)發(fā)酵香腸的風(fēng)味，其氨基酸組成更有利于人體健康，且在一定程度上可減少TVB-N 的釋放，提高產(chǎn)品的安全性。