紫蘇子油O/W型納米微乳的制備及其氧化穩(wěn)定性

易 醒，羅俊溢，駱葉晴，易孜成，李威鋼，吳心成，肖小年*

（1 南昌大學(xué) 中德食品工程中心 南昌330047 2 南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院 南昌330047）

紫蘇（Perilla frutescens）是一年生草本植物[1]，在我國華中和西南一帶大量栽培[2]。古典著作《名醫(yī)附錄》 中提到紫蘇具有促進(jìn)血液循環(huán)的作用，《本草綱目》中也記載紫蘇具有祛寒散風(fēng)、緩解中氣的作用[1]。此外，紫蘇子油具有抗氧化[3]，抗腫瘤[4]，抗菌以及抑制真菌[5]，抗炎[6]，抗過敏[7]，抗抑郁[8-9]的作用，還具有降低總膽固醇和低密度脂蛋白所載膽固醇[10]的作用。紫蘇子油中含有大量的α-亞麻酸（ω-3 脂肪酸），占脂肪酸總量的61.1%～64.0%[11-13]，其次為亞油酸和油酸，含量差異不大，均占脂肪酸總量的15.0%左右，此外還有少量的三?；视?、甾醇和磷脂類物質(zhì)[14]，具有較高的食用價(jià)值。

紫蘇子油中的不飽和脂肪酸含量較多，在存放過程中可能受微生物、重金屬、氧氣、溫度等因素影響，使其不利于加工和食用。同時(shí)，紫蘇子油直接食用時(shí)不具備良好的適口性，且不宜消化，降低了紫蘇子油的生物利用度。為增加紫蘇子油的生物利用度和貯藏穩(wěn)定性，可將紫蘇子油通過制備成O/W 納米乳、固體脂質(zhì)體、微膠囊等傳遞體系，以提高溶解性、穩(wěn)定性和生物可及性[15]。O/W型納米乳是由水、油和雙親性物質(zhì)表面活性劑組成的熱力學(xué)穩(wěn)定的各向同性液體，乳液的平均粒徑通常小于100 nm[16]。O/W 型納米乳的制備方法通常分為2 種：高能乳化法（如微流控、高壓均質(zhì)化）和低能乳化法（如自發(fā)乳化和相轉(zhuǎn)變?nèi)榛?。高能乳化法可能會破壞多不飽和油脂的化學(xué)穩(wěn)定性[17]，而低能法具有操作便捷，反應(yīng)條件適宜等優(yōu)勢，因此低能乳化法更適合用于制備含生物脂質(zhì)類的納米乳劑，也是一種極具應(yīng)用前景的低水不溶性生物活性化合物的制備技術(shù)[18-19]。同時(shí)，O/W納米乳劑特別適用于食品，是因?yàn)樗苋菀着c大多數(shù)食品體系中的其它成分兼容。

本研究中，主要使用低能乳化法將紫蘇子油制備成O/W 納米乳劑。首先選出適合制備微乳的表面活性劑，然后根據(jù)親水親油值（HLB）的可加性，將選出的表面活性劑間進(jìn)行兩兩混合，制備出具有不同HLB 值的復(fù)合表面活性劑，選擇肉豆蔻酸異丙酯（IPM）作為空白油相，通過偽三元相圖篩選具有較大載油量的空白微乳配方，最后將空白微乳配方中的IPM 置換成紫蘇子油或者將IPM與紫蘇子油按比例混合制備紫蘇子油納米乳劑，研究紫蘇子油納米微乳的離心穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性以及電位和粒徑，為紫蘇子油在食品加工中相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紫蘇子油，荷澤中禾健元生物科技有限公司；肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、Tween80、Span80、Tween20、Span20、EL-40，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；無水乙醇 （C2H5OH）、聚乙二醇（PEG-400）、異辛烷、異丙醇、甲醇、正丁醇、硫氰酸銨、四水合氯化亞鐵、六水合氯化鐵、蘇丹Ⅲ、亞甲基藍(lán)均為分析純級，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

T6-紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TDL-5-A 離心機(jī)，廈門精藝興業(yè)有限責(zé)任公司；Zetasizer Nano 激光散射粒度分析儀，英國Malven 公司；RH-DS25 磁力攪拌器，德國IKA 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 表面活性劑的確定 選擇表面活性劑Tween20、Span20、Span80、EL-40 和Tween80 （表1），與IPM 按9∶1 和8∶2 的質(zhì)量比混合后，然后邊攪拌（300 r/min、50 ℃）邊滴加去離子水。仔細(xì)觀察體系的外觀狀態(tài)，若體系從黏稠變稀薄并澄清透明或半透明則說明微乳形成。

表1 表面活性劑、助表面活性劑的HLB 值Table 1 The HLB value of surfactant and cosurfactant

1.3.2 空白微乳的篩選 根據(jù)HLB 值的可加性，將選出的表面活性劑兩兩混合，制備出不同HLB值的復(fù)配表面活性劑。將其與IPM 按不同比例預(yù)混合后，將蒸餾水逐滴加入預(yù)混料中。微乳制備成功后鑒定，根據(jù)偽三元相圖中可形成微乳區(qū)域面積大小尋找最佳組合。

式中，Ma，Mb——表面活性劑a 和b 在復(fù)合表面活性劑中所占的質(zhì)量比；HLBa，HLBb——表面活性劑a 和b 各自所對應(yīng)的HLB 值[20]。

1.3.3 紫蘇子油微乳的制備 根據(jù)空白微乳篩選出的配方，將IPM 替換成紫蘇子油，或?qū)PM 與紫蘇子油按比例混合，采用轉(zhuǎn)相乳化法（50 ℃）制備微乳。

1.3.4 微乳的穩(wěn)定性測定 將制備的納米微乳體系在4 000 r/min 條件下離心15 min，選擇未出現(xiàn)沉淀和分層且載油量最大的配方作為后續(xù)體外釋放試驗(yàn)的最終配方。

1.3.5 微乳類型的鑒定 采用染色法鑒定微乳的類型。取微乳10 mL 于樣品瓶中，分別滴入蘇丹Ⅲ溶液（無水乙醇配制，0.1%體積分?jǐn)?shù)）和亞甲基藍(lán)溶液（蒸餾水配制，0.1%體積分?jǐn)?shù)）5 μL，靜置30 min，觀察2 種染料在微乳中的擴(kuò)散速度。

1.3.6 微乳的粒徑和電位測定 使用激光散射粒度分析儀測定微乳制備12 h 后的平均液滴大小、粒徑分布和電位，樣品預(yù)先稀釋100 倍。測定參數(shù)設(shè)置：紫蘇子油折射率設(shè)為1.52，吸收率設(shè)為0.001，分散劑折射率設(shè)為1.33，樣品的平衡時(shí)間為180 s。微乳平均粒徑用d4，3來表示，且所有樣品均重復(fù)測定3 次。

1.3.7 紫蘇子油的氧化穩(wěn)定性測定 將紫蘇子油的過氧化值（POV）作為紫蘇子油氧化穩(wěn)定性的判定依據(jù)，紫蘇子油的POV 值的測定參考Zhong 等[21]的方法。取360 μL 樣品于離心管中，加入1.8 mL異辛烷/異丙醇（3∶1，體積比）混合溶液，振蕩3 min，于5 000 r/min 離心30 min。取離心后的上清液600 μL，分別加入45 μL 硫氰酸銨溶液（3.94 mol/L）和新制Fe2+溶液（0.14 mol/L），再用甲醇/正丁醇（2∶1，體積比）混合溶液定容至10 mL，搖勻，在暗室中反應(yīng)30 min 后，用分光光度計(jì)在510 nm波長處測定吸光值。使用600 μL 的異辛烷/異丙醇（3∶1，體積比）混合溶液作為空白對照。

先配制好100 μg/mL 的Fe3+溶液，分別取100，150，200，250，300，350，400 μL Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加45 μL 硫氰酸銨溶液（3.94 mol/L），用甲醇/正丁醇（2∶1，體積比）定容至7 mL，配制成1.43，2.14，2.68，3.57，4.29，5.00，5.70 μg/mL 的Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩搖勻，在暗室中反應(yīng)30 min 后，用分光光度計(jì)在510 nm 波長處測定吸光值。以甲醇/正丁醇（2∶1，體積比）混合溶液作為空白對照。

式中，A——樣品的吸光度 （A=A樣-A空）；b——Fe3+標(biāo)曲的截距；10——反應(yīng)總體積（mL）；k——Fe3+標(biāo)曲的斜率；2——Fe3+與H2O2的反應(yīng)摩爾比；56——Fe3+的摩爾質(zhì)量（g/mol）。

固定紫蘇子油的用量為0.25 g，根據(jù)篩選出的3 個(gè)最佳工藝配方（HLBTween80/Span20=14.0，HLBTween80/Span20=13.0 和HLBEL-40/PEG-400=13.5）制備微乳后，均加水稀釋至10 mL，然后將制備的樣品置于37 ℃烘箱中密封保存1，3，5，7，9，12，15 d，根據(jù)上述方法測定紫蘇子油微乳在對應(yīng)時(shí)間 （d） 下的POV 值。將單一的紫蘇子油作為對照，平行3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一表面活性劑的篩選

表面活性劑的篩選結(jié)果如表2所示，選擇的表面活性劑（SA）為Tween80 和EL-40 時(shí)，且SA∶Oil=9∶1（質(zhì)量比）時(shí)，可形成澄清透明的微乳液，當(dāng)表面活性劑為Span80、Span20、Tween20 時(shí)，形成白色乳狀液，因?yàn)镾pan20 和Span80 的HLB 值小于9，Tween80、EL-40 和Tween20 的HLB 值都大于15，為了復(fù)配表面活性劑的需要，選擇Tween80、EL-40、Span20 和Span80 作為本次試驗(yàn)的表面活性劑。

2.2 空白微乳的篩選

結(jié)果見表3和圖1。當(dāng)Tween80 和Span20 復(fù)配的HLB 值為9～12，且復(fù)合表面活性劑與IPM比值控制在8∶2 時(shí)，均不能形成微乳。當(dāng)Tween80和Span20 復(fù)配的HLB 值為13～14，且復(fù)合表面活性劑與IPM 的質(zhì)量比在8∶2 時(shí)，都可形成微乳，通過比較復(fù)配表面活性劑（Tween80/Span20）的HLB值在13 和14 時(shí)的微乳區(qū)域面積，發(fā)現(xiàn)當(dāng)復(fù)合表面活性劑（Tween80/Span20）的HLB 值為14 時(shí)形成的微乳區(qū)域較大。當(dāng)Tween80 和Span80 復(fù)配的HLB 值為13，且與IPM 的質(zhì)量比在9∶1 時(shí)，可形成微乳，同時(shí)此組合形成的微乳區(qū)域在所有組合中的面積最小。當(dāng)EL-40 和PEG-400 復(fù)配的HLB 值為13.5，且復(fù)合表面活性劑與IPM 的質(zhì)量比在8∶2 時(shí)，可形成穩(wěn)定的微乳體系。當(dāng)EL-40和無水乙醇進(jìn)行復(fù)配時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)HLBEL-40/無水乙醇=15時(shí)能形成穩(wěn)定的微乳，然而該條件下形成的微乳區(qū)域較小。將制備的納米微乳體系進(jìn)行離心處理（4 000 r/min，15 min），不出現(xiàn)沉淀和分層，且將其繼續(xù)稀釋10 倍后，在稀釋過程中保持澄清狀態(tài)，因此選擇Tween80/Span20 和EL-40/PEG-400 兩個(gè)配方用于制備紫蘇子油微乳。

表2 單一表面活性劑篩選結(jié)果Table 2 Results of microemulsion by single surfactant

表3 空白微乳配方篩選結(jié)果Table 3 Results of blank microemulsion formula screening

圖1 空白微乳篩選的偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram of blank microemulsion formula screening

2.3 納米微乳的制備

Tween80/Span20 制備的紫蘇子油微乳在HLB=13.0 時(shí)，若將IPM 直接換成紫蘇子油，則不能形成微乳，然而將IPM 與紫蘇子油以3∶2 的質(zhì)量比混合后可制備出微乳，可能是因?yàn)镮PM 對紫蘇子油具有一定的增溶作用（表4）。使用Tween80/Span20制備的紫蘇子油微乳在HLB=14.0 時(shí)，將IPM 與紫蘇子油質(zhì)量比1∶1 混合后制備的微乳液載油量最高，此結(jié)論和篩選空白微乳時(shí)的結(jié)論一致，說明在相同條件下，空白微乳的篩選對紫蘇子油的包載具有明確的指導(dǎo)意義。同理，以EL-40/PEG-400為表面活性劑制備的微乳與以Tween80 和Span20 制備的微乳情況相似。通過比較所制備的紫蘇子油的微乳區(qū)域面積（圖2），可得出SHLBTween80/Span20=14.0>SHLBTween80/Span20=13.0>SHLBEL-40/PEG-400=13.5。通過對所制備紫蘇子油微乳的穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)，其穩(wěn)定性較好，因此Tween80/Span20 的表面活性劑組合最適合用于制備紫蘇子油微乳。

2.4 微乳的類型鑒定

圖3從左到右分別代表HLBTween80/Span20=13.0、HLBTween80/Span20=14.0、HLBEL-40/PEG-400=13.5 時(shí)的紫蘇子油微乳體系，在制備好的紫蘇油微乳中分別滴入蘇丹Ⅲ溶液和亞甲基藍(lán)溶液。結(jié)果表明，蘇丹Ⅲ溶液一直滯留在微乳的表面，而亞甲基蘭溶液慢慢擴(kuò)散到整個(gè)微乳體系中，說明所制得的3 種微乳液都是O/W 型微乳。

2.5 微乳的粒徑和電位

當(dāng)復(fù)合表面活性劑Tween80/Span20 的HLB值為13 時(shí)制備的紫蘇子油微乳，其液滴的平均粒徑為458.6 nm，電位為-26.2 mV，PDI（聚合物分散系數(shù)）指數(shù)為0.517，此時(shí)形成的微乳粒徑相對較大，PDI 較大，電位絕對值較小，可能是因?yàn)槿橐旱伍g的靜電屏蔽較小，微乳液滴間容易發(fā)生聚集（圖4）。當(dāng)Tween80/Span20 的HLB 值為14 時(shí)制備的紫蘇子油微乳，其液滴的平均粒徑為53.1 nm，PDI 為0.197，電位為-34.6 mV，此時(shí)形成的微乳粒徑較小，乳滴間的靜電屏蔽作用較大，可阻止乳滴間的橋連聚集，此時(shí)形成的微乳穩(wěn)定性較好。當(dāng)EL-40/PEG-400 的HLB 值為13.5 時(shí)制備的紫蘇子油微乳，其液滴的平均粒徑為69.16 nm，電位為-32.0 V，PDI 為0.281，此時(shí)形成的微乳的性質(zhì)與Tween80/Span20 的HLB 值為14 時(shí)制備的微乳液相似，都具備較好的貯藏穩(wěn)定性。

表4 紫蘇子油微乳的制備Table 4 Preparation of perilla oil microemulsion

2.6 微乳的氧化穩(wěn)定性

2.6.1 Fe3+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 對不同質(zhì)量濃度Fe3+的測定結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，F(xiàn)e3+在1.43～5.70 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。通過線性擬合可得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程Y=0.1566x+0.0049，R2=0.9976。

圖2 紫蘇子油微乳的偽三元相圖和實(shí)物圖Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram and photograph of perilla oil microemulsion

圖3 紫蘇子油微乳的類型鑒定結(jié)果Fig.3 Results of perilla oil microemulsion type identification

2.6.2 紫蘇子油微乳的氧化穩(wěn)定性分析 紫蘇子油過氧化值（POV）可用于評估納米乳劑中脂質(zhì)氧化程度（圖6）。通過試驗(yàn)可得，納米乳液的過氧化值隨貯藏時(shí)間的延長而上升。將貯藏15 d 后的納米乳劑和紫蘇子油相比，在37 ℃下貯存的紫蘇子油過氧化值顯著升高（P＜0.05）。貯存15 d 后納米乳劑的過氧化物值約為初始貯存階段（1 d） 的3倍，而紫蘇子油約為3.6 倍。通過比較不同配方制備的紫蘇子油微乳的POV 值，發(fā)現(xiàn)3 種微乳的POV 值變化相似，且在貯藏15 d 后的POV 值均低于國家標(biāo)準(zhǔn)（9.85 mmol/kg）。表明紫蘇子油制備成納米乳液后可長期貯存，氧化穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

采用低能乳化法，以表面活性劑的HLB 值為指導(dǎo)對表面活性劑進(jìn)行合理復(fù)配，再結(jié)合偽三元相圖，篩選出性質(zhì)穩(wěn)定且載油量較大的微乳配方。表面活性劑組合為Tween80/Span20 和EL-40/PEG400 兩種，當(dāng)Tween80 和Span20 的HLB混=13～14 時(shí)，制備的空白微乳（以IPM 為油相）其微乳區(qū)域面積隨混合表面活性劑HLB 值的增大而增大。同時(shí)，將該組合用于制備紫蘇子油微乳時(shí)，發(fā)現(xiàn)在Tween80/Span20 復(fù)配表面活性劑的HLB值為14 時(shí)，制備出的微乳的區(qū)域面積最大；當(dāng)EL-40 和PEG-400 的HLB混=13.5 時(shí)，也可制備穩(wěn)定的空白微乳（以IPM 為油相）。將上述組合用于制備紫蘇子油微乳時(shí)，Tween80/Span20 復(fù)配表面活性劑的HLB=14.0 時(shí)，制備出的微乳的區(qū)域面積最大，當(dāng)EL-40/PEG-400 復(fù)配表面活性劑的HLB=13.5 時(shí)，制備出的微乳的區(qū)域面積最小。對所得紫蘇子油微乳的類型進(jìn)行鑒定可知，3 種配方工藝 （HLBTween80/Span20=13.0、HLBTween80/Span20=14.0、HLBEL-40/PEG-400=13.5）得到的微乳均為O/W 型乳劑，且3 種配方工藝制備的微乳的平均粒徑分別為458.60，53.10，69.16 nm，電位為-26.2，-34.6，-32.0 mV，除了第1 種配方工藝，其它2 種配方制備的微乳粒徑較小，電位的絕對值較大，再次佐證了所制備的微乳穩(wěn)定性良好。最后，通過對比37 ℃貯存條件下的紫蘇子油微乳和紫蘇子油的POV 值，結(jié)果表明紫蘇子油微乳具有較高的氧化穩(wěn)定性。本研究制備的紫蘇子油微乳在食品開發(fā)中的應(yīng)用前景十分廣闊，將具有生物活性的脂質(zhì)運(yùn)用在傳遞體系中，可能會產(chǎn)生各種生物功能效應(yīng)，并可進(jìn)一步研究如何增加紫蘇子油微乳在胃腸體系中的生物利用度等問題。

圖4 紫蘇子油微乳的粒徑和電位分析Fig.4 Particle size and Zeta potential analysis of perilla oil microemulsion

圖5 Fe3+標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Fig.5 Results of Fe3+ standard curve

圖6 紫蘇子油微乳在37 ℃下保存15 d 的過氧化值Fig.6 The peroxidation value of perilla oil microemulsion stored at 37 ℃for 15 days