雙蛋白對異基因造血干細(xì)胞移植小鼠造血及免疫重建的影響

武小亮，盧林綱，王 靖，張婧婕，侯清華，韓 娟

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所 北京100081）

異基因造血干細(xì)胞移植（Allo-HSCT）是治療惡性血液腫瘤，如白血病、淋巴瘤等的有效治療手段[1]。移植前的放療和化療，青春期后胸腺功能的退化，供受體主要組織復(fù)合物不相容，移植排斥等多種因素，影響移植后免疫功能缺陷的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間[2-3]。長期的免疫缺陷會(huì)導(dǎo)致由機(jī)會(huì)性感染所引起的較高風(fēng)險(xiǎn)的死亡率[4-5]。免疫功能的損傷修復(fù)，特別是淋巴細(xì)胞亞群的恢復(fù)往往影響移植后患者總體生存率。加快移植后患者造血及免疫重建對提高移植成功率具有十分重要的意義。

造血干細(xì)胞移植前的清髓處理，一方面導(dǎo)致患者腸胃功能紊亂，影響營養(yǎng)攝??；另一方面增加的蛋白消耗，引起患者負(fù)氮平衡[6-7]，以上不良結(jié)果可能導(dǎo)致移植后患者免疫重建時(shí)間延長。另外，研究表明白血病患者若營養(yǎng)不良就會(huì)導(dǎo)致糟糕的治療結(jié)果[8]。白血病患者造血干細(xì)胞移植后，需要良好的營養(yǎng)狀態(tài)以加快機(jī)體損傷修復(fù)和促進(jìn)造血及免疫功能重建，蛋白營養(yǎng)在其中扮演重要角色。

優(yōu)質(zhì)動(dòng)、植物蛋白質(zhì)具有提高機(jī)體免疫力及增加肌肉合成等的生理功能。優(yōu)質(zhì)動(dòng)、植物蛋白的代表，如大豆分離蛋白與乳清蛋白均具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，能夠提高機(jī)體免疫功能[9-10]。將大豆分離蛋白和乳清蛋白這2 種優(yōu)質(zhì)動(dòng)、植物蛋白混合成雙蛋白營養(yǎng)補(bǔ)充物，探究其對白血病患者骨髓移植術(shù)后的營養(yǎng)支持和干預(yù)作用。最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)造血干細(xì)胞移植的白血病患者服用雙蛋白營養(yǎng)補(bǔ)充劑后，雙蛋白能夠促進(jìn)患者造血植入，提高患者血清中蛋白含量，具有降低患者感染的趨勢[11]。此研究在一定程度上表明雙蛋白營養(yǎng)補(bǔ)充有利于造血干細(xì)胞移植后患者的預(yù)后。造血干細(xì)胞移植后免疫重建狀況決定著移植成功率，雙蛋白營養(yǎng)補(bǔ)充對造血干細(xì)胞移植后造血及免疫重建的作用如何尚未見報(bào)道。本文通過建立異基因造血干細(xì)胞移植小鼠模型，設(shè)計(jì)雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評估雙蛋白在骨髓造血干細(xì)胞移植術(shù)后對小鼠造血及免疫功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

供鼠為SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，體重21～23 g；受鼠為SPF 級雄性BALB/c 小鼠，體重21～23 g。供鼠和受鼠均購于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均按照SPF 級飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)。環(huán)境適應(yīng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)預(yù)處理7 d 前開始飲用慶大霉素水直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 試劑藥品與儀器

雙蛋白復(fù)合營養(yǎng)粉（Dual-protein food nutrition power）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院雙蛋白工程技術(shù)研究中心研制，北京康比特體育科技股份有限公司生產(chǎn)。以高品質(zhì)大豆分離蛋白和乳清蛋白為主要營養(yǎng)基料，輔以膳食纖維和功能性營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)科學(xué)配方制作而成，營養(yǎng)成分含量如表1所示。

表1 營養(yǎng)成分表Table 1 Nutrition information

流式細(xì)胞術(shù)所需抗體PE-H-2Kb、APC-H-2Kd、BV510-Sca1、BV421-CD34、APC-CD Flk3、FITC-Lineage，美國Bio Legend 公司；PE-cKit，美國Tonbo Bio 公司；血細(xì)胞分析用溶血素，同生時(shí)代生物技術(shù)公司；小鼠脾組織處理用Spleen Dissociation Kit，美國Miltenyi 公司；慶大霉素粉末，中國KEHBIO 公司；總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司；免疫球蛋白（IgA、IgE、IgG）檢測試劑盒，北京金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司。

DxFLEX 流式細(xì)胞儀，美國BECKMAN COULTER 公司；BC-2600 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，Mindray（中國）公司；KHB-1280 全自動(dòng)生化分析儀、KHB L-3180 半自動(dòng)生化分析儀，上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.3 異基因造血干細(xì)胞移植（Allo-HSCT）

將供鼠C57BL/6（H-2Kb）采用頸椎脫位法處死后，置于75%酒精中浸泡消毒15 min；在超凈工作臺(tái)上無菌取出股骨、脛骨，剔除肌肉組織后用眼科剪剪開骨頭骨骺，使骨髓腔暴露，用注射器吸取RPMI-1640 培養(yǎng)液并反復(fù)沖洗骨髓腔直至發(fā)白，收集沖洗后液體于無菌15 mL 離心管中，充分吹打后將骨髓細(xì)胞懸液以1∶1 比例緩慢貼壁加入Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液表面，水平離心 （2 000 r/min，20 min），取中間白膜層細(xì)胞；離心后得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×107/mL；受鼠BALB/c（H-2Kd）小鼠接受8 Gy（分2 次照射，每次4 Gy，間隔4 h）γ 射線全身輻照，劑量率為0.89 Gy/min；輻照后4～6 h 經(jīng)尾靜脈注射5×106個(gè)供鼠骨髓細(xì)胞（200 μL/只）。

1.4 雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)

將75 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分成3 組：正常對照組（CON）、造血干細(xì)移植組（HSCT+NP）、造血干細(xì)胞移植+雙蛋白干預(yù)組（HSCT+PP），每組25 只小鼠。造血干細(xì)胞移植后第1 天開始進(jìn)行蛋白營養(yǎng)干預(yù)，根據(jù)蛋白粉在生理鹽水中的最大溶解度，HSCT+PP 組小鼠給予蛋白的質(zhì)量濃度為335 mg/mL 的灌胃處理，灌胃量為200 μL/只；其余2 組小鼠均給予等體積的生理鹽水。造血干細(xì)胞移植術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)4 周，每周檢測各組小鼠血常規(guī)及體重變化情況，每2 周隨機(jī)處死各組6 只小鼠，取小鼠全血測定供體嵌合率，剩余血液用于收集血清檢測生化指標(biāo)。解剖后取其相應(yīng)組織器官用于測定脾臟和胸腺指數(shù)，并在第4 周分離骨髓細(xì)胞，測定小鼠造血干細(xì)胞各細(xì)胞亞型的含量和組成。

1.5 體重及血常規(guī)測定

各組小鼠每周稱量體重后，內(nèi)眥采血50 μL于0.5 mL 肝素鈉抗凝管中，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測定各組小鼠各類血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 器臟指數(shù)測定

摘眼球取血后，脫頸處死小鼠，解剖取其脾臟和胸腺，濾紙拭去組織表面殘余血液和其它液體，稱量濕重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.7 血清生化指標(biāo)測定

采集各組小鼠外周血于1.5 mL 離心管中，2 000×g 離心10 min，收集血清。測定血清樣品總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及IgM、IgA、IgG 的含量。所有檢測均按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)

供體嵌合率分析：使用MACS 組織解離試劑盒結(jié)合gentle MACS C 管和美天旎組織處理器，將脾臟處理成單細(xì)胞懸液，用70 μm 過濾器過濾，用15 mL 試管收集細(xì)胞懸液；1 500 r/min 離心5 min，棄上清后加入1 mL PBS 重懸細(xì)胞，取100 μL 細(xì)胞懸液加入事先預(yù)混好的含有H-2Kd（APC） 和H-2Kb （PE） 的抗體中，常溫孵育15 min；加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，裂解10 min，1 500 r/min 離心5 min，棄上清后1 mL PBS 重懸細(xì)胞。洗1 遍，棄上清，加入200 μL PBS 重懸細(xì)胞并上機(jī)檢測。

造血干細(xì)胞含量分析：取處死后的小鼠后腿股骨，剔除肌肉組織，用眼科剪剪開骨頭骨骺，使骨髓腔暴露，用注射器吸取RPMI-1640 培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，反復(fù)吹打成單細(xì)胞原液，收集細(xì)胞懸液于15 mL 離心管中；1 500 r/min 離心5 min，棄上清后，加入1 mL PBS 重懸細(xì)胞，取100 μL 細(xì)胞懸液加入事先預(yù)混好的含有Lin-FITC、c Kit-PE、BV-510-Sca1、BV-421-CD34、APC-Flk3 的抗體中，常溫孵育15 min；其余步驟與脾臟流式操作完全相同。其中Lin-c-kit+sca1+代表造血干細(xì)胞（HSC）；Lin-c-kit+Sca1+CD34-Flt3-代表長期造血干細(xì)胞（LT-HSC）；Lin-c-Kit+Sca1+CD34+Flt3-代表短期造血干細(xì)胞 （ST-HSC）；Lin-c-Kit+Sca1+CD34-Flt3-代表多能祖細(xì)胞（MPP）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2 組數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn)，2 組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD 多重比較法進(jìn)行均值比較。各組數(shù)據(jù)均采用±s 表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙蛋白粉對小鼠造血干細(xì)胞移植后體重和供體嵌合率的影響

如圖1a 所示，各組小鼠在移植后第7 天體重降至最低值，而后體重不斷回升，組間體重變化無明顯差異 （P>0.05），然而移植后第21，28 天HSCT+PP 組小鼠體重均高于HSCT+NP 組小鼠。如圖1b 所示，移植后第14，28 天2 組小鼠供體嵌合情況無明顯差異，然而蛋白干預(yù)組小鼠在第28天供體嵌合率高于未干預(yù)組 （分別為91.0%±1.1%，85.5%±4.5%，P>0.05）。以上結(jié)果表明，雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)在一定程度上有利于造血干細(xì)胞移植術(shù)后小鼠體重的恢復(fù)，同時(shí)有利于提高移植后小鼠供體嵌合率，促進(jìn)造血干細(xì)胞植入。

圖1 雙蛋白對小鼠造血干細(xì)胞移植后體重及供體嵌合率的影響Fig.1 Effect of double protein on body weight and donor chimerism in mice after hemopoietic stem cell transplantation （HSCT）

2.2 雙蛋白對造血干細(xì)胞移植后小鼠血細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)的影響

經(jīng)過物理輻照后，小鼠造血系統(tǒng)受到完全損傷，血細(xì)胞被破壞清除，射線照射后外周血細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，骨髓移植后各組血細(xì)胞數(shù)量仍繼續(xù)降低到達(dá)最低值后逐漸恢復(fù)，經(jīng)歷了一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。如圖2所示，移植后第7 天除紅細(xì)胞外，其它各類細(xì)胞計(jì)數(shù)均降至最低值且組間無顯著差異，而后均逐漸恢復(fù)。HSCT+PP 組小鼠在移植后第14 天白細(xì)胞（WBC）和淋巴細(xì)胞（LYMPH）數(shù)目顯著高于HSCT+NP 組小鼠（P＜0.05）；此外，第21，28 天2 類細(xì)胞數(shù)量均高于HSCT+NP 組小鼠而無顯著差異（圖2a，圖2d）。移植后21 d 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)HSCT+PP 組極顯著高于HSCT+NP 組（P＜0.01），第28 天顯著高于HSCT+NP 組小鼠（P＜0.05）（圖2b）。如圖2c 所示，HSCT+PP 組小鼠在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血小板（PLT）計(jì)數(shù)均顯著高于HSCT+NP 組小鼠（P＜0.05）。2 組小鼠中性粒細(xì)胞（NEUT）和單核細(xì)胞（MONO）計(jì)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異。以上結(jié)果表明：造血干細(xì)胞移植后雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)有利于小鼠WBC、RBC、PLT、LYMPH數(shù)量恢復(fù)，尤其對PLT 數(shù)量恢復(fù)最為明顯，對NEUT 和MONO 數(shù)量恢復(fù)雖無顯著差異，但雙蛋白干預(yù)組展現(xiàn)更好的恢復(fù)趨勢。

圖2 雙蛋白粉對小鼠造血干細(xì)胞移植后血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Fig.2 Effect of double protein on the number of peripheral blood cells of mice after HSCT

2.3 雙蛋白對骨髓移植后小鼠造血干細(xì)胞含量和組成的影響

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙蛋白營養(yǎng)支持加快了骨髓移植后小鼠造血干細(xì)胞植入和部分血細(xì)胞數(shù)目和類型的恢復(fù)。為探究雙蛋白發(fā)揮這一作用的功效機(jī)理，進(jìn)一步對移植后第28 天各組小鼠造血干細(xì)胞含量和亞型進(jìn)行分析。結(jié)果如圖3所示，HSCT+PP 組小鼠造血干細(xì)胞（LSK，Lin-Sca1+ckit+）總量高于HSCT+NP 組（分別為4.26%±1.22%，3.69%±0.57%，P＞0.05）；長期造血干細(xì)（Lin-c-kit+Sca1+CD34-Flt3-，LT-HSCT） 和短期造血干細(xì)胞（Lin-cKit+Sca1+CD34+Flt3-，ST-HSC） 在2 組小鼠中含量相當(dāng)，無顯著差異；而多能祖細(xì)胞（Linc-Kit+Sca1+CD34-Flt3-，MPP）HSCT+PP 組小鼠含量顯著高于HSCT+NP 組 （分別為0.37%±0.23%，0.19%±0.04%，P＜0.05）。以上結(jié)果表明，造血干細(xì)胞移植后雙蛋白營養(yǎng)支持有利于提高小鼠造血干細(xì)胞（LSK）和多潛能造血祖細(xì)胞（MPP）的含量，說明雙蛋白促進(jìn)了造血干細(xì)胞的定植、增殖和分化，進(jìn)一步促進(jìn)了移植后HSCT+PP 組血細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)。

圖3 雙蛋白對骨髓移植后小鼠骨髓中造血干細(xì)胞比例的影響Fig.3 Effect of double protein on the percentage of HSCs of bone marrow in mice after HSCT

2.4 雙蛋白對小鼠造血干細(xì)胞移植后臟器指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其大小能夠在一定程度上反應(yīng)機(jī)體免疫功能狀態(tài)[12-14]。因此，對移植后第14，28 天各組小鼠的胸腺和脾臟進(jìn)行稱重并計(jì)算器臟指數(shù)。結(jié)果如圖4a 所示，移植后HSCT+PP 組和HSCT+NP 組小鼠胸腺均發(fā)生不同程度的萎縮，且HSCT+NP 組小鼠胸腺萎縮明顯。移植后第14 天，HSCT+NP 組小鼠胸腺指數(shù)極顯著低于CON 組小鼠 （分別為0.47±0.53，1.04±0.15，P＜0.05），同時(shí)也低于HSCT+PP 組小鼠（分別為0.47±0.53，0.85±0.13，P＞0.05），然而無顯著差異。在移植的第28 天，HSCT+NP 組小鼠胸腺指數(shù)均極顯著低于CON 組和HSCT+PP 組小鼠 （分別為0.48±0.6，1.26±0.7 以及0.48±0.6，1.05±0.7，P＜0.01）。與此同時(shí)，HSCT+NP 組小鼠胸腺指數(shù)隨移植后時(shí)間的推移基本沒有任何變化，而HSCT+PP組小鼠胸腺指數(shù)逐漸恢復(fù)至正常水平。對于脾臟指數(shù)而言，3 組小鼠的脾臟指數(shù)在移植后的第14，28 天無明顯差異（圖4b）。以上結(jié)果表明，雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)有利于造血干細(xì)胞移植后小鼠胸腺指數(shù)恢復(fù)，減小胸腺萎縮。

圖4 雙蛋白粉對小鼠造血干細(xì)胞移植后小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響Fig.4 Effect of double protein on thymus and spleen index of mice after HSCT

2.5 雙蛋白對小鼠造血干細(xì)胞移植后血清生化指標(biāo)的影響

如表2所示，造血干細(xì)胞移植后第28 天，HSCT+NP 組小鼠血清總蛋白（TP）含量低于對照組和HSCT+PP 組，且顯著低于CON 組。HSCT+PP組和HSCT+NP 組小鼠血清白蛋白（ALB）顯著低于對照組。各組小鼠血清AST、ALT 含量無顯著差異。移植組小鼠的IgG 和IgA 含量均低于對照組，而無顯著差異。HSCT+PP 組小鼠IgM 含量高于其它2 組，且顯著高于HSCT+NP 組小鼠。以上結(jié)果表明，造血干細(xì)胞移植后小鼠血清TP、ALB、IgG、IgA、IgM 含量均會(huì)發(fā)生不同程度降低，雙蛋白營養(yǎng)支持具有提高其含量的趨勢。

表2 造血干細(xì)胞移植后第28 天各組小鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果（±s）Table 2 Serum biochemical indices of each group on day 28 after HSCT （±s）

表2 造血干細(xì)胞移植后第28 天各組小鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果（±s）Table 2 Serum biochemical indices of each group on day 28 after HSCT （±s）

注：數(shù)值后不同小寫字母表示具有顯著差異（P＜0.05）。

指標(biāo) 組別對照組 HSCT+PP HSCT+NP總蛋白（TP）/g·L-1 64.82±1.26a 62.63±0.38ab 60.85±0.63b白蛋白（ALB）/g·L-1 37.30±0.40a 33.80±0.88b 33.10±0.57b谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）/U·L-1 57.36±4.85 63.07±3.87 58.09±3.11谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）/U·L-1 48.96±3.69 49.25±1.45 45.38±0.84免疫球蛋白G（IgG）/g·L-1 2.60±0.19 2.45±0.67 2.37±0.85免疫球蛋白A（IgA）/g·L-1 1.48±0.50 1.44±0.52 1.36±0.43免疫球蛋白M（IgM）/g·L-1 0.34±0.01ab 0.36±0.00a 0.33±0.00b

3 討論

異基因造血干細(xì)胞移植是治療惡性血液病腫瘤的潛在治療手段，然而移植后長期的免疫缺陷是移植后導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)率和死亡率高的主要因素之一，并且使患者較易受機(jī)會(huì)性感染所導(dǎo)致的不良影響[1，15-16]。因此，加快血液病患者造血干細(xì)胞移植后造血及免疫重建具有十分重要的意義。造血干細(xì)胞移植前的放化療清髓處理，導(dǎo)致患者腸胃功能紊亂，影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收，并致使患者出現(xiàn)負(fù)氮平衡現(xiàn)象[8-9]。因此，移植后蛋白營養(yǎng)補(bǔ)充顯得非常重要。乳清蛋白消化吸收效率快，氨基酸釋放迅速，而大豆分離蛋白消化吸收相對緩慢，氨基酸前期釋放雖緩慢，但持續(xù)性較好，2 種蛋白混合后，能夠互補(bǔ)兩者在氨基酸釋放上的優(yōu)勢，有利于氨基酸持續(xù)性的供給[17]。對于蛋白營養(yǎng)制品有利于提高免疫功能的研究經(jīng)常被報(bào)道[18-20]，最近在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，白血病患者經(jīng)過造血干細(xì)胞移植治療后，服用雙蛋白有利于促進(jìn)造血植入，改善蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良癥，并提高血清蛋白水平[11]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。雙蛋白是否有利于造血干細(xì)胞移植后患者造血及免疫重建尚未見報(bào)道。因此，本研究建立異基因造血干細(xì)胞移植動(dòng)物模型，進(jìn)行雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)，探究雙蛋白營養(yǎng)補(bǔ)充對移植后小鼠造血和免疫重建的影響。

研究結(jié)果表明，雙蛋白對骨髓移植后小鼠體重恢復(fù)及供體嵌合率具有正向促進(jìn)作用，同時(shí)能夠促進(jìn)移植后小鼠外周血血細(xì)胞的恢復(fù)，尤其對血小板的恢復(fù)作用最為明顯，說明雙蛋白營養(yǎng)支持有利于移植后小鼠造血干細(xì)胞植入和造血功能重建。外周血所有血細(xì)胞均由骨髓中造血干細(xì)胞分化而來[21]，因此，外周血血細(xì)胞的重建與骨髓中造血干細(xì)胞的含量密切相關(guān)[22]。通過對移植后28 d 各組小鼠造血干細(xì)胞含量的分析發(fā)現(xiàn)雙蛋白干預(yù)組（HSCT+PP）的造血干細(xì)胞（LSK cell）和多潛能祖細(xì)胞（MPP）含量多于未干預(yù)組（HSCT+NP）小鼠，這可能解釋了HSCT+PP 組小鼠血細(xì)胞恢復(fù)快于HSCT+NP 的原因。脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，其器官完整性反應(yīng)了機(jī)體免疫功能狀況[23-24]。造血干細(xì)胞移植前的清髓處理導(dǎo)致患者胸腺發(fā)生萎縮，從而延緩T 細(xì)胞重建[25]。通過對移植后第14，28 天各組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，胸腺指數(shù)結(jié)果與鄧紅等[26]的研究結(jié)果十分相似，蛋白營養(yǎng)干預(yù)能夠提高老年大鼠的胸腺指數(shù)，而在本研究中發(fā)現(xiàn)雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)能夠顯著提高移植后小鼠胸腺指數(shù)。這在一定程度上說明，雙蛋白營養(yǎng)補(bǔ)充有利于促進(jìn)免疫器官損傷修復(fù)，提高機(jī)體免疫功能，其發(fā)揮作用的靶點(diǎn)可能主要在胸腺。

免疫球蛋白是動(dòng)物免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B 細(xì)胞或記憶B 細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的，是機(jī)體免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子，其含量直接反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)[21，27]。造血干細(xì)胞移植后，在各組小鼠經(jīng)歷免疫系統(tǒng)的重建過程中，通過對血清免疫球蛋白含量的分析，來反應(yīng)小鼠免疫重建狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSCT+PP 組小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM 的含量均高于HSCT+NP 組，且IgM 含量顯著高于HSCT+NP 組。這與蛋白質(zhì)粉對老齡大鼠抗衰老作用的研究中[28]，蛋白粉營養(yǎng)補(bǔ)充能夠提高大鼠血清IgG、IgA、IgM 含量，且顯著提高IgM 含量的結(jié)果完全相同。2 項(xiàng)研究均表明大豆分離蛋白與乳清蛋白的混合蛋白能顯著提高相關(guān)動(dòng)物模型的血清免疫蛋白含量，尤其是IgM 含量。這可能與蛋白補(bǔ)充后可改善機(jī)體氨基酸水平有關(guān)[29]，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究加以闡述。另外，本研究中造血干細(xì)胞移植的小鼠血清蛋白含量低于正常組小鼠，表明移植組小鼠蛋白合成能力降低，機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)下降[30]。HSCT+NP 組小鼠血清總蛋白含量顯著低于正常組小鼠，而HSCT+PP 組與正常組無明顯差異，且TP 含量高于HSCT+NP 組小鼠，表明雙蛋白營養(yǎng)干預(yù)提高了造血干細(xì)胞移植后小鼠血清的TP 含量。

通過本研究，證明了大豆分離蛋白與乳清蛋白形成的混合雙蛋白能夠加快造血干細(xì)胞移植后小鼠造血重建，并提高骨髓中造血干細(xì)胞含量，明顯改善胸腺萎縮，增加小鼠胸腺指數(shù)和血清免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）和血清總蛋白（TP）含量。總之，雙蛋白能夠加快造血干細(xì)胞移植后小鼠造血及免疫功能重建和恢復(fù)。