大鼠和小鼠術后疲勞綜合征模型的建立與評價

張雯雯，尹雪蕾，王洛萱，李勁草，李 碩，張 楊，李 迎，張有志，王恒林，薛 瑞

（1.河北北方學院研究生院，河北 張家口 075000；2.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心麻醉科，北京 100091；3.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

術后疲勞綜合征（postoperative fatigue syn?drome，POFS）由 Merton［1］首次提出，是指外科手術尤其是腹部大手術后，患者在康復過程中出現(xiàn)的以疲倦、肌無力、嗜睡、注意力和活動力下降為主的一系列臨床癥狀［2-4］。非復雜大手術即可導致65%患者在術后首月出現(xiàn)POFS，復雜大手術患者POFS的發(fā)生率更高，持續(xù)時間長達3個月［5-6］。POFS的發(fā)生率和持續(xù)時間甚至超過術后疼痛［7］，延長了患者恢復時間并降低患者生活質量，造成嚴重的經濟和社會負擔。國內外對POFS的研究起步較晚，POFS的發(fā)病機制和治療靶標尚不明確，目前以對癥治療為主，治療方法有限。

POFS病理機制研究和新藥評價依賴于理想的動物模型和可靠的評價指標，但目前POFS模型研究同樣嚴重滯后，進一步制約了POFS病理機制和新藥研究。目前，POFS模型構建主要以大鼠為研究對象，造模方式上主要以70%小腸切除為主要手段，但小腸切除-吻合術需要在體視顯微鏡下完成，手術時間長，操作難度大，且術后有出現(xiàn)腸漏和短腸綜合征的風險。70%肝切除術最早為研究肝細胞再生和肝移植而建立，手術方法成熟且具有手術時間短、動物成活率高的特點，可滿足新藥評價需求。我們在PubMed上以“postoperative fatigue AND hepatectomy（術后疲勞和肝切除術）”為關鍵詞進行文獻檢索（檢索時間2021-02-10），僅有21篇文獻報道，而在動物水平進行肝切術致POFS研究的僅2篇，分別采用活動性和懸尾實驗進行疲勞表型的檢測。鑒于以肝切除術進行POFS造模僅有少量報道，缺乏明確的客觀檢測指標和敏感種屬研究，本研究以SD大鼠和C57BL/6J小鼠（簡稱C57小鼠）為實驗對象，采用70%肝切除術構建POFS動物模型，并采用活動性測試、抓力測試、跑臺實驗、負重游泳實驗和生理信號遙測技術對模型動物疲勞狀態(tài)、肌肉力量、運動耐力和睡眠結構進行多指標綜合評價。確定敏感種屬和評價指標后，評價經典抗疲勞藥物咖啡因的治療作用，并通過檢測血糖、肌糖原和肝糖原水平評價POFS病理生理機制和咖啡因抗疲勞作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級SD大鼠，雄性，體重220～240 g；47只SPF級C57小鼠，雄性，體重20～22 g；均購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～24℃，濕度40%～70%，12 h晝夜明暗交替（8∶00-20∶00），自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)7 d，每天抓取撫摸，而后進行手術及行為學測試。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司；75%乙醇，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；碘伏，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；青霉素，重慶新吉亨藥業(yè)有限公司；水合氯醛和濃硫酸，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸羅哌卡因，河北一品制藥股份有限公司；咖啡因（批號：1011809066），石藥集團新諾威制藥股份有限公司；糖原檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

通用活動箱及行為學分析軟件，上海吉量軟件技術有限公司；大鼠抓力測試儀，濟南益延科技發(fā)展有限公司；小鼠抓力測定儀，上海欣軟信息科技有限公司；小動物跑臺，江蘇賽昂斯生物技術有限公司；腦立體定位儀和顱骨鉆，瑞沃德生命科技有限公司；F50-EEE無線遙感植入子、RPC-1信號接收板和NeuroScore 3.1.1腦電分析軟件，美國DSI公司；血糖儀及試紙片，上海羅氏ACCU-CHEK公司。

1.3 POFS模型的建立

經適應性飼養(yǎng)后，大、小鼠分別按體重均衡隨機分為正常對照組（n=10）和POFS模型組（大鼠n=10，小鼠n=10）。POFS模型組采用70%肝切除術構建POFS模型，大鼠手術方法按照Madrahimov等［8］和Sumer等［9］的報道，小鼠手術方法參照Palmes等［10］的報道。大、小鼠禁食不禁水12 h，5%水合氯醛麻醉結合羅哌卡因局部鎮(zhèn)痛。大鼠切除肝左葉和肝中葉、小鼠切除肝中央小葉和肝左小葉制備POFS模型。術后單獨飼養(yǎng)，連續(xù)3 d im給予青霉素（100 kU·d-1）防止感染。于術后不同時間進行行為學檢測，實驗流程見圖1。

Fig.1 Test procedure of postoperative fatigue syndrome（POFS）model in rats（A）and mice（B）.Rats or mice were divided into normal control group and POFS model group according to their body mass.The normal control group was not treated，and of the POFS group was established by 70% hepatectomy.

1.4 大鼠和小鼠一般狀態(tài)和體重觀測

從術前1 d開始，每天觀察大鼠或小鼠的自我清潔能力、排便情況和毛發(fā)色澤，并進行瞇眼評分（瞇眼評分標準：全睜記為0分，睜3/4記為1分，睜1/2記為2分，睜1/3記為3分，全閉記為4分）。分別記錄正常和模型組手術前1 d、手術當天和術后第1，3，5和7天大鼠或小鼠的體重，繪制體重增長曲線。

1.5 大鼠和小鼠活動性測試

分別于術后第1，2和3天進行大鼠活動性測試，于術后第1，3，5和7天進行小鼠活動性測試。大鼠或小鼠在安靜的實驗室適應60 min后，頭朝向左上角放入自發(fā)活動測試箱〔大鼠為黑色正方形（50 cm×50 cm×50 cm），小鼠為白色正方形（25 cm×25 cm×25 cm）〕中，適應5 min后，記錄10 min內的運動距離。

1.6 大鼠和小鼠抓力測試

采用大鼠或小鼠抓力測試儀進行抓力測試，以反映動物的肌肉力量。于術后第1，2和3天測試大鼠抓力［11］，術后第1，3，5和7 天測試小鼠抓力。適應性抓取訓練后，將大鼠或小鼠輕輕放于抓力板上，抓住鼠尾后1/3向后平行于抓力板均勻牽拉，直至其松爪，記錄抓力，重復測量3次，取平均值。

1.7 大鼠和小鼠力竭游泳實驗

采用力竭游泳實驗反映動物的運動耐力。術后第3和4天，實驗大鼠尾部負其體重8%的鉛塊后放入自制大鼠游泳缸〔直徑50 cm×高70 cm，水深50 cm，水溫（28±1）℃〕，記錄游泳力竭潛伏期。力竭標準為頭部沒入水中＞8 s且不再浮出水面。

術后第4，6和8天，實驗小鼠尾部負其體重10%的鉛塊后放入自制小鼠游泳缸〔直徑18 cm×高50 cm，水深30 cm，水溫（21±1）℃〕，記錄力竭潛伏期。力竭標準為頭部沒入水中＞10 s且不再浮出水面。

1.8 大鼠睡眠監(jiān)測實驗

POFS建模前，參照Petrovic等［12］的方法手術安放植入子。5%水合氯醛麻醉，頭頸部手術區(qū)域備皮、消毒后，大鼠固定在腦立體定位儀手術臺上，縱向切開皮膚，暴露顱骨，找到bregma點（位于冠狀縫和矢狀縫的交接處），在其左右各2 mm處劃定標記，顱骨鉆鉆孔后將植入子導線置于顱骨下，但不穿破硬腦膜，植入子主體部分置于大鼠背部皮下（n=4）。術后單籠飼養(yǎng)5 d后，采集24 h內大鼠基礎腦電特征，以觀察其睡眠情況。然后同1.3方法建立POFS模型，手術蘇醒后立即置于信號接收板上監(jiān)測24 h腦電特征，采用NeuroScore軟件根據(jù)δ波和θ波等特征自動進行睡眠時相分類，分別為清醒（awake）、活動清醒（active awake）、異相睡眠（paradoxical sleep，PS）和慢波睡眠（slow wave sleep，SWS）時相，計算24 h周期內時相累計持續(xù)時間百分比。各時相累計持續(xù)時間百分比（%）=各時相累計持續(xù)時間（min）×100/24×60（min）。

1.9 小鼠跑臺運動實驗

術后第3，5和7天進行小鼠跑臺運動實驗，以反映小鼠的運動耐力。參照Dougherty等［13］的方法稍做修改。實驗分跑臺訓練和測試2步進行。訓練過程中設置跑臺傾斜角為0°，電擊強度為2.5 mA，共分3次進行。第1次訓練速度從2 m·min-1開始，到10 m·min-1結束，歷時10 min；第2次訓練速度從 4 m·min-1開始，到 12 m·min-1結束，歷時13 min；第3次訓練速度從8 m·min-1開始，到14 m·min-1結束，歷時15 min；加速度均為100 m·min-2，待小鼠學會跑步后可進行跑臺測試。測試過程中跑臺傾斜角為0o，電擊強度為1.5 mA，加速度仍為100 m·min-2，流程為14 m·min-1持續(xù)2 min，16 m·min-1持續(xù) 3 min，18 m·min-1持續(xù)25 min，20 m·min-1持續(xù)15 min，22 m·min-1持續(xù)15 min，24 m·min-1持續(xù)15 min，26 m·min-1持續(xù)30 min。測試時記錄從開始運動到疲勞的運動距離。疲勞標準為小鼠始終在跑道后1/3段，跑步姿勢由正常變?yōu)榉厥剑粑贝佟?/p>

1.10 在小鼠POFS模型上評價咖啡因抗疲勞作用

27只C57小鼠按體重均衡隨機分為正常對照組、模型組和模型+咖啡因組（n=7～9），模型組和模型+咖啡因組按照1.3方法構建小鼠POFS模型，正常對照組不做處理。于術后第1，3和5天行為學實驗和尾靜脈取血前30 min分別給藥1次，術后第1天進行活動性測試，術后第3天進行活動性和跑臺測試（實驗方法同1.5和1.9），術后第5天各組尾靜脈采血測血糖，并將小鼠處死，取肝和肌肉組織，參照試劑盒方法測定肝糖原和肌糖原含量。正常對照組和模型組ip給予生理鹽水（10 mL·kg-1），模型+咖啡因組ip給予咖啡因3 mg·kg-（110 mL·kg-1）。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 POFS模型大鼠一般狀態(tài)、活動性、肌肉力量和運動耐力

與正常對照組相比，模型組大鼠在術后第1和2天出現(xiàn)松毛、豎毛、毛發(fā)枯槁、眼周鼻周污穢附著和糞便黃軟等現(xiàn)象，手術當天瞇眼評分顯著增加（P＜0.01，圖2A）；術后第1，3，5和7 天體重顯著下降（P＜0.05，P＜0.01，圖2B）；術后第1天活動性顯著下降（P＜0.01，圖2C）；2組大鼠在術后第1和3天抓力稍有降低，但無顯著性差異（圖2D）；術后第3和4天力竭游泳時間有升高趨勢，但無顯著性差異（圖2E）。

Fig.2 Behavioral phenotype of POFS model in SD rats.POFS in rats was induced by 70% hepatectomy，and squint score（A），body mass（B），travel distance（C），grip strength（D）and exhaustive swimming time（E）were recorded according to the test procedure as shown in Fig.1A.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 POFS模型大鼠睡眠結構

如圖3所示，與術前1 d相比，POFS模型組大鼠術后當天及術后第1天總清醒時間百分比顯著減少（P＜0.01，P＜0.05，圖3A），總睡眠時間百分比顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，圖3B），活動清醒時間百分比顯著減少（P＜0.01，P＜0.05，圖3D），慢波睡眠時間百分比顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，圖3F）。

Fig.3 Sleep structure of POFS model in SD rats.Elec?trodes were surgically implanted in rats，and 5 d later basic sleep was monitored before 70% liver resection was used to estab?lish the POFS model.After waking up，the sleep structure of 24 h were monitored.The time percentages of total awake（A），total sleep（B），awake（C），active awake（D），paradoxical sleep（E）and slow wave sleep（F）were recorded.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with baseline data recorded on the day before hepatectomy.

2.3 POFS模型小鼠一般狀態(tài)、活動性、肌肉力量和運動耐力

結果如圖4所示，與正常對照組相比，模型組小鼠術后第1，2和3天出現(xiàn)松毛、豎毛、毛發(fā)枯槁、眼周鼻周污穢附著、糞便黃軟等現(xiàn)象，手術當天及術后第1 天瞇眼評分顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，圖4A）；術后第1，3，5和7 天體重顯著下降（P＜0.05，P＜0.01，圖4B）；術后第1和3天活動性顯著下降（P＜0.01，圖4C）；術后第1，3和5天抓力顯著降低（P＜0.01，圖4D）；術后第3和5天跑臺運動距離顯著減少（P＜0.01，圖4E），術后第4和6天力竭游泳時間無顯著性差異（圖4F）。

Fig.4 Behavioral phenotype of POFS model in C57 mice.POFS in mice was induced by 70% hepatectomy，and squint score（A），body weight（B），travel distance（C），grip strength（D），treadmill distance（E）and exhaustive swimming time（F）were recorded according to the test procedure as shown in Fig.1B.x± s，n=10. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 咖啡因對POFS模型小鼠活動性和跑臺運動距離的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠術后第1和3天自發(fā)活動距離顯著減少（P＜0.01，圖5A），術后第3天跑臺運動距離顯著減少（P＜0.01，圖5B）；與模型對照組相比，模型+咖啡因組小鼠術后第1和3天自發(fā)活動距離顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，圖5A），術后第3天跑臺運動距離顯著增加（P＜0.05，圖5B）。

Fig.5 Effect of caffeine on travel distance（A）and treadmill distance（B）in POFS model in mice.Mice in the POFS group and POFS+caffeine group were treated with 70% hepatectomy，and caffeine（3 mg·kg-1）was ip given 30 min before each behavioral test.±s，n=7-9.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with POFS group.

2.5 咖啡因對POFS模型小鼠血糖、肝糖原和肌糖原水平的影響

如圖6所示，與正常對照組相比，模型組小鼠在術后第5天血糖（P＜0.01）、肝糖原（P＜0.01）和肌糖原（P＜0.05）水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+咖啡因組較模型組肝糖原和肌糖原水平較模型組顯著升高（P＜0.05），血糖變化無顯著性差異。

Fig.6 Effect of caffeine on blood glucose（A），liver glycogen（B）and muscle glycogen（C）in POFS model in mice.Mice in POFS group and POFS+caffeine group were treated with 70% hepatectomy，and caffeine（3 mg·kg-1）was ip given on the 5thday after operation，then blood was collected from the tail vein for blood glucose measurement，and liver and muscle tissues were collected for liver glycogen and muscle glycogen test.x± s，n=7-9. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with POFS group.

3 討論

理想動物模型應滿足表觀有效性、預測有效性和結構有效性3個基本要求［14］。表觀有效性指動物模型應盡可能復制人類疾病的行為學表現(xiàn)；預測有效性指藥物或治療手段在模型動物和臨床患者有效性應具有一致性；結構有效性是指模型動物與臨床患者具有相似的病因、病程發(fā)展和病理生理機制。自1954年POFS概念被首次提出后，關于術后疲勞病因的文獻研究［15-17］不斷出現(xiàn)。現(xiàn)有研究證據(jù)表明，POFS是由生理、心理和社會因素共同作用的結果，其病理生理機制可能與應激-內分泌紊亂引起的能量代謝障礙有關［18］。

鑒于肝切除術具有手術時間短、動物成活率高的特點，因此本研究采用70%肝切除術構建了大鼠POFS模型，發(fā)現(xiàn)大鼠術后出現(xiàn)了活動性下降、瞇眼、自我清潔能力下降、排稀便和毛發(fā)枯槁等疲勞樣表現(xiàn)，但疲勞表型僅可持續(xù)1 d。Lu等［19］以70%肝切除術制備大鼠POFS模型，分別檢測了術后第1天和第7天大鼠的活動性，發(fā)現(xiàn)術后疲勞表型可持續(xù)7 d，但其采用的是單因素方差分析，我們采用的是兩因素重復測量方差分析，持續(xù)時間的不一致可能與統(tǒng)計方法有關。為了進一步明確POFS的發(fā)病機制，為POFS模型提供合適的客觀指標，本研究采用生理遙測技術對術后大鼠進行了睡眠監(jiān)測，旨在評價POFS對睡眠時間和結構的影響。結果顯示，70%肝切除術后大鼠出現(xiàn)睡眠異常，表現(xiàn)為總清醒時間百分比減少和總睡眠時間百分比增加，提示POFS大鼠術后可能具有嗜睡樣表現(xiàn)。進一步睡眠結構分析表明，POFS大鼠出現(xiàn)的睡眠異常以慢波睡眠百分比增加和活動清醒時間百分比減少為特征，且與疲勞表征持續(xù)和恢復時間相一致。鑒于慢波睡眠的增加有利于促進體力的恢復［21］，本研究認為大鼠術后雖出現(xiàn)嗜睡樣表現(xiàn)，但慢波睡眠的增加可能是術后大鼠迅速恢復的原因，該發(fā)現(xiàn)為深入研究POFS提出了線索，也為大鼠POFS模型維持時間較短提供了實驗依據(jù)。需要指出的是，由于生理遙測技術平臺的植入子數(shù)量有限，本研究每組僅監(jiān)測了4只大鼠的睡眠結構，雖然組內大鼠具有良好的一致性，但后續(xù)仍有待增加動物例數(shù)進行更為深入的研究。綜上，本研究實驗結果表明，大鼠POFS可能只適用于術后急性疲勞評價，可綜合采用活動性和睡眠監(jiān)測為客觀指標進行評價。

如前所述，目前POFS模型構建主要以大鼠為研究對象，未見小鼠POFS模型的報道。鑒于大鼠POFS模型表型持續(xù)時間僅1 d，且客觀檢測指標有限，而小鼠部分肝切除術亦可成功實現(xiàn)，因此本研究以C57小鼠為研究對象又構建了小鼠POFS模型，并采用多種指標綜合評價了模型小鼠的疲勞狀態(tài)、肌肉力量、有氧和無氧運動耐力。本研究發(fā)現(xiàn)，70%肝切除同樣可引起小鼠活動性下降、瞇眼、自我清潔能力下降、排稀便和毛發(fā)枯槁等術后疲勞樣表現(xiàn)，疲勞表型可持續(xù)5 d，且POFS小鼠出現(xiàn)了跑臺有氧運動耐力和肌肉力量的下降。因此，小鼠POFS模型可綜合采用活動性、運動耐力和肌肉力量為客觀指標進行評價。

由上述研究結果可知，大鼠POFS模型和小鼠POFS模型維持時間有較大差異，且2個種屬動物疲勞表型的持續(xù)時間與臨床特征相差較遠，這可能有3個方面的原因：第一，不同種屬動物造模敏感性可能不同，即使同一種屬不同品系動物敏感性亦可能不同；第二，不同種屬動物的肝再生速度和機制不同，根據(jù)文獻報道，肝再生速度大鼠＞小鼠＞人［22-25］；第三，臨床疾病發(fā)生的影響因素較之實驗動物更為復雜，這也是動物模型普遍的局限之處。綜上，小鼠POFS模型可模擬臨床術后患者出現(xiàn)的多種疲勞樣表現(xiàn)，具有良好的表觀效度。

需要指出的是，本研究在大、小鼠模型構建上選擇了不同的檢測方法和流程，這主要是由于大、小鼠模型的維持時間不同。由于大鼠POFS模型持續(xù)時間短，小鼠持續(xù)時間長，所以大鼠活動性和抓力檢測選擇了在術后第1，2和3天進行，小鼠選擇在術后第1，3，5和7天，目的是確定出現(xiàn)表型的時間和表型消失的時間，為后續(xù)藥物評價提供依據(jù)。此外，由于小鼠同時進行了跑臺和負重游泳實驗，所以二者交替進行檢測，跑臺分別在第3，5和7天檢測，負重游泳分別在術后第4，6和8天檢測。而大鼠表型消失快，跑臺實驗又需要在術后傷口恢復3 d才能進行，此時表型已經消失，故未進行跑臺實驗。對于生理信號監(jiān)測，大鼠和小鼠都可以作為研究對象；但是相對而言，小鼠由于體型更小，植入子植入后對其自身正?；顒拥挠绊戄^大鼠大，穩(wěn)定性也不如大鼠，因此本研究只對大鼠進行了睡眠監(jiān)測。

在確定小鼠是POFS造模的敏感種屬后，本研究以經典抗疲勞藥物咖啡因為陽性對照藥，對模型的預測效度和結構效度進行了評價。結果表明，咖啡因可顯著改善70%肝切除所致小鼠活動性和跑臺運動耐力下降，提示其在小鼠POFS模型中具有治療作用。血糖是正常生理活動和耐力運動的最重要的供能物質，疲勞與體內肌糖原和肝糖原分解速度過快、無法維持血糖正常水平有關［26-27］。再加上手術創(chuàng)傷會引起機體應激，進而引起內分泌和代謝紊亂，在胰島素抵抗及兒茶酚胺類物質分泌共同作用下加速分解代謝，尤其是血糖的利用度會大幅提升，而術前禁食會進一步降低血糖，因此以血糖和糖原為代表的供能物質不足可能是POFS發(fā)生的重要病理生理機制。本研究在小鼠POFS模型中發(fā)現(xiàn)，模型小鼠在術后第5天仍表現(xiàn)為血糖、肌糖原和肝糖原含量顯著下降，而咖啡因可以顯著提高POFS小鼠肌糖原和肝糖原水平以維持血糖穩(wěn)定，咖啡因影響糖原含量的確切機制有待進一步研究?？梢娦∈驪OFS模型具有良好的預測效度和結構效度。

綜上，本研究成功建立了大鼠和小鼠POFS模型，其中大鼠POFS模型僅能用于術后急性疲勞評價，小鼠POFS模型可作為POFS病生機制研究和新藥評價的合適動物模型。