VX染毒小鼠乙酰膽堿酯酶活性和含量與作用時(shí)間的相互關(guān)系

黃靜宜，章子男，2，李 堯，3，邢歡純，王 琦，王永安，楊 軍

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，高毒物質(zhì)對(duì)抗藥物研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.中國人民解放軍95865部隊(duì)，北京 102200；3.中國人民解放軍32292部隊(duì)，黑龍江牡丹江 157000；4.中國人民解放軍32265部隊(duì)，廣東 廣州 510000）

神經(jīng)性毒劑（nerve agent）是20世紀(jì)30年代研制殺蟲劑時(shí)發(fā)展起來的，屬于有機(jī)磷酸酯類化合物，迄今為止這類毒劑在外軍裝備的化學(xué)戰(zhàn)劑中毒性最大，主要分為G類和V類。G類有塔崩（tabun，GA）、沙林（sarin，GB）和梭曼（soman，GD），V類主要有VX，VM和VE。VX為S-（2-二異丙基氨乙基）-甲基硫代磷酸乙酯，由瑞典籍化學(xué)家拉斯·埃里克·塔梅林于1957年發(fā)明，在美國和前蘇聯(lián)等軍事大國的化學(xué)武器庫中有大量貯存，是目前毒性最強(qiáng)的神經(jīng)性毒劑［1-2］。由于VX具有物理性質(zhì)穩(wěn)定、揮發(fā)度小、使用量低、持續(xù)沾染時(shí)間長、脂溶性強(qiáng)和極易透皮吸收等特性，極少量接觸后即可造成嚴(yán)重中毒。2017年吉隆坡機(jī)場暗殺事件中使用的就是這種毒劑［3］。

神經(jīng)性毒劑的主要作用機(jī)制是毒劑分子與乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）底部的活性絲氨酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，從而抑制其水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）的生理作用，造成ACh在突觸間隙蓄積，進(jìn)一步引發(fā)膽堿能系統(tǒng)功能紊亂［4］。而對(duì)染毒后中樞和外周AChE與VX間的量效關(guān)系、AChE含量和活性在體內(nèi)隨時(shí)間的變化以及毒劑分子的實(shí)際起效量與總?cè)径玖恐g的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究選擇昆明種小鼠為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)不同劑量VX對(duì)小鼠腦和外周血AChE活性及含量隨時(shí)間變化的影響，探索相關(guān)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

VX，純度≥95%，陸軍防化學(xué)院合成，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解。NaCl，MgCl2·6H2O，NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine，ATCH）、Tris堿、二硫基雙硝基苯甲酸（dithiobisnitrobenzoate，DTNB）和Triton X-100，美國Sigma公司；小鼠AChE含量測定ELISA試劑盒，江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；所有化學(xué)試劑均為分析純。

高速低溫組織研磨儀（KZ-III-F），武漢塞維爾生物科技有限公司；高速低溫離心機(jī)（3-18K），美國Sigma公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9080），上海一恒科技有限公司；酶標(biāo)儀（VERSA max），美國MD公司；渦旋儀（Ql-901），海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組和染毒處理

昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。小鼠按體重隨機(jī)分組，頸部sc給予VX 0（正常對(duì)照組，n=10），5，10和16 μg·kg-1，分別于染毒后10 min，1 h，4 h，24 h，48 h和72 h（每劑量每時(shí)間點(diǎn)n=10）摘除眼球收集外周血，并將小鼠處死后取全腦，記錄腦重，計(jì)算腦系數(shù)。腦系數(shù)=腦重（g）/體重（g）×100。

1.3 Ellman法測定小鼠腦和外周血AChE活性

將1.2中收集的外周血按照1∶100加入去離子水，渦旋混勻；將1.2中收集的全腦組織在濾紙上去除所沾血液后稱重，加入1.3 mL膽堿酯酶提取液（含NaCl 58.44 g·L-1，MgCl2·6H2O 10.165 g·L-1，Tris堿1.2114 g·L-1和Triton X-100 10 mL·L-1的水溶液），勻漿后離心10 min（4℃，13 000×g），吸取上清液按1∶25加入PBS，渦旋混勻。處理后的外周血和腦組織樣品加入96孔酶標(biāo)板，每樣品設(shè)6復(fù)孔，前3孔加入80 μL PBS，后3孔加入50 μL PBS和30 μL ATCH溶液（含0.086% ATCH的PBS），離心1 min（4℃，1000×g）去除孔內(nèi)氣泡，37℃恒溫箱孵育30 min，各孔加入20 μL含0.03% DTNB的PBS，在酶標(biāo)儀415 nm下測定各孔吸光度（A415nm）值，計(jì)算腦和外周血AChE活性抑制率。抑制率（%）=1-染毒組A415nm/正常對(duì)照組A415nm。

1.4 ELISA測定小鼠腦和外周血AChE含量

將1.2中收集的外周血離心15 min（4℃，3000×g）取上清（即血清）；腦組織處理方法同1.3。按ELISA試劑盒說明書操作，每樣品設(shè)3復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測定各孔A450nm值，以標(biāo)準(zhǔn)孔濃度為橫坐標(biāo)，A450nm值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程。血清和腦組織樣品加樣及檢測步驟同標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品A450nm值帶入回歸方程，計(jì)算樣品AChE含量。

1.5 小鼠腦和外周血中被VX抑制的AChE量和VX實(shí)際消耗量計(jì)算

有研究表明，在分子層面上抑制1個(gè)酶僅需消耗1個(gè)毒劑分子［5］。根據(jù)Ellman法和ELISA所得數(shù)據(jù)，計(jì)算腦和外周血中被不同劑量VX抑制的AChE量、毒劑的理論消耗量及其占實(shí)際染毒總劑量的百分比。具體計(jì)算公式如下：

其中，P為腦或外周血中被VX抑制的AChE量，N為VX實(shí)際消耗百分比（即腦或外周血內(nèi)與AChE結(jié)合的VX占染毒總劑量的百分比），c為ELISA測得的腦或外周血中AChE含量（μmol·L-1），I為Ellman法測得的腦或外周血中AChE抑制率（%），S為小鼠腦系數(shù)，D為VX劑量（μg·kg-1），Mr為VX的相對(duì)分子質(zhì)量，n為染毒總劑量（nmol），m為小鼠體重（g），式①中1.3為實(shí)驗(yàn)中制備腦樣品時(shí)加入的液體體積（mL），式②中5.83/100為每100 g體重小鼠含5.83 mL血液的理論值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠VX中毒癥狀

小鼠VX染毒后24 h內(nèi)，參照文獻(xiàn)［6］神經(jīng)毒劑中毒程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，VX 5 μg·kg-1組小鼠出現(xiàn)輕度流涎癥狀，屬于輕度中毒；10 μg·kg-1組70%小鼠在染毒15 min后出現(xiàn)多汗和支氣管黏液分泌增多的癥狀，30%的小鼠出現(xiàn)輕度抽搐，屬于中度中毒；16 μg·kg-1組全部出現(xiàn)多汗和支氣管黏液分泌增多的癥狀，70%的小鼠出現(xiàn)中重度抽搐，20%死亡，屬于重度中毒。

2.2 VX對(duì)小鼠體重、腦重和腦系數(shù)的影響

如圖1所示，不同劑量VX染毒后，在72 h內(nèi)各染毒組小鼠體重、腦重和腦系數(shù)與正常對(duì)照組比較均未見明顯差異，各組體重均呈增長趨勢。

Fig.1 Effect of VX exposure on body mass（A），brain mass（B）and brain coefficient（C）in mice.Mice were subcutaneously injected with VX 0（normal control group），5，10 and 16 μg·kg-1，the body mass and brain mass were recorded at 10 min,1 h,4 h,24 h,48 h and 72 h to calculate the brain coeffi?cient.Brain coefficient=brain mass（g）/body mass（g）×100.x±s，n=10.

2.3 VX對(duì)小鼠腦和外周血AChE活性的影響

與同劑量組10 min時(shí)的結(jié)果比較，VX 5和10 μg·kg-1組外周血AChE活性抑制率在染毒4 h顯著下降（P＜0.01）；16 μg·kg-1組在染毒24 h顯著下降（P＜0.01）。各組外周血AChE活性抑制率均在染毒48 h達(dá)到最低，且數(shù)值接近；72 h均略微回升（圖2A）。

Fig.2 Inhibition of VX on acetylcholinesterase（AChE）activity in peripheral blood（A）and brain（B）of mice by Ellman assay.See Fig.1 for the mouse treatment.Inhibi?tory rate of AChE（%）=1-A415 nmof experiment group/A415 nmof normal control group.x±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding VX group 10 min after exposure.

與同劑量組10 min時(shí)的結(jié)果比較，5 μg·kg-1組腦AChE活性抑制率在24 h時(shí)顯著上升（P＜0.01），而在其他時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化；10 μg·kg-1組在染毒48和72 h顯著下降（P＜0.01）；16 μg·kg-1組在48 h內(nèi)隨染毒時(shí)間的延長而逐漸下降，在4～72 h下降幅度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。各組腦AChE活性抑制率均在染毒48 h達(dá)最低，且數(shù)值接近；72 h均略微回升（圖2B）。

總體而言，不同劑量VX染毒組小鼠腦和外周血中AChE活性抑制率在24 h后變化趨勢基本一致，且抑制率接近，均在48 h時(shí)達(dá)最低值，72 h出現(xiàn)一定程度地回升。

2.4 VX對(duì)小鼠腦和外周血AChE含量的影響

通過ELISA測得AChE濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為c（nmol· L-1）=133.74A450nm-1.8325，r2=0.9968。利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠外周血AChE的含量，結(jié)果見表1。與正常對(duì)照組相比，VX 5 μg·kg-1組外周血AChE含量在1 h明顯降低（P＜0.01），24 h明顯升高（P＜0.05）；16 μg·kg-1組在10 min和4 h均顯著降低（P＜0.01）；而10 μg·kg-1組各時(shí)間點(diǎn)未見明顯變化。

Tab.1 Effect of VX on AChE content in peripheral blood of mice by ELISA

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠腦AChE含量結(jié)果見表2。與正常對(duì)照組相比，5 μg·kg-1組腦AChE含量在4 和 72 h顯著下降（P＜0.01）；10 μg·kg-1組在1，24和72 h均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；而16 μg·kg-1組僅在1 h時(shí)顯著下降（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)均與正常對(duì)照組無明顯差異。

Tab.2 Effect of VX on AChE content in brain tissue of mice by ELISA

2.5 小鼠腦和外周血被VX抑制的AChE量

在外周血中被VX抑制的AChE量如表3所示。與同劑量組10 min時(shí)相比，5 μg·kg-1組小鼠外周血與VX結(jié)合的AChE量在染毒后1，24，48和72 h顯著下降（P＜0.01）；10 μg·kg-1組在染毒后1～72 h持續(xù)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；16 μg·kg-1組在染毒后24～72 h顯著下降（P＜0.01）。

Tab.3 Content of AChE inhibited by VX in peripheral blood of mice

腦內(nèi)被VX抑制的AChE量如表4所示。與同劑量組10 min時(shí)相比，5 μg·kg-1組小鼠腦內(nèi)被VX抑制的AChE量在染毒后1和48 h時(shí)顯著下降（P＜0.01），在其他時(shí)間點(diǎn)的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10和16 μg·kg-1組在染毒后 24～72 h 均持續(xù)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.4 Content of AChE inhibited by VX in brain tissue of mice

2.6 小鼠腦和外周血VX消耗量

理論上，在分子層面上抑制1個(gè)酶僅需消耗1個(gè)毒劑分子［5］。由公式⑤推算得出，本研究中最大染毒劑量（16 μg·kg-1）的毒劑總劑量約為2 nmol。在各劑量和各時(shí)間點(diǎn)中，VX 16 μg·kg-1在染毒10 min時(shí)VX總消耗量最高，外周血和腦中VX消耗量分別為0.08 nmo（l表3）和0.48 nmo（l表4），總消耗量為0.56 nmol，占染毒總劑量的28%。提示有大量毒劑殘余體內(nèi)，尚未參與反應(yīng)。

染毒后72 h內(nèi)VX的實(shí)際消耗量占染毒總劑量的百分比如圖3所示，與同劑量組10 min時(shí)相比，10和16 μg·kg-1組在24，48和72 h時(shí)外周血和腦內(nèi)VX消耗量均同時(shí)明顯下降（P＜0.01），5 μg·kg-1組在1，48和72 h時(shí)外周血和腦內(nèi)VX消耗量均同時(shí)明顯下降（P＜0.01）。

Fig.3 Consumption of VX in brain and peripheral blood of mice at different VX doses.See Fig.1 for the mouse treatment.N（%）=P/（D/Mr）×100%.N：effective consumption of VX（%）in the brain and peripheral blood；D：the total dose of VX；Mr：relative molecular mass of VX.±s，n=10. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 10 min exposure in corresponding dose group.

3 討論

與G類毒劑相比，VX具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：物理性質(zhì)更穩(wěn)定，揮發(fā)度小，可造成環(huán)境長時(shí)間染毒［7］；水解速度慢，與羧酯酶和磷酸化磷酸酶的反應(yīng)更溫和［8］，在體內(nèi)穩(wěn)定存在可達(dá)12 h［9-12］；體內(nèi)氧化酶含量少，活性低，中毒后自發(fā)解毒能力有限；致死劑量低，無論何種中毒途徑VX的毒性均居于首位［13-14］。本研究采用經(jīng)典的Ellman法和ELISA評(píng)價(jià)了不同劑量VX下小鼠腦和外周AChE活性和含量隨時(shí)間的變化，探索相關(guān)規(guī)律。

VX染毒后動(dòng)物出現(xiàn)中毒癥狀和死亡比G類毒劑遲，中重度毒劑量染毒后15 min出現(xiàn)癥狀，20 min出現(xiàn)死亡，而沙林中重度劑量染毒8 min出現(xiàn)癥狀，10 min出現(xiàn)死亡［15］。雖然對(duì)這種延遲的生物學(xué)基礎(chǔ)還未完全闡明，但目前研究認(rèn)為，導(dǎo)致VX比G類毒劑更慢地通過組織和細(xì)胞膜擴(kuò)散到目標(biāo)組織的主要原因是較大的相對(duì)分子質(zhì)量和低溶解度［16-17］。

從酶的抑制率和時(shí)間的關(guān)系看，在VX中毒后24 h內(nèi)，毒劑與酶處于不斷結(jié)合的階段，外周血和腦中AChE抑制率的變化與毒劑使用量、中樞的生理性屏障有關(guān)；而經(jīng)24 h充分地循環(huán)代謝后，毒劑與酶的結(jié)合達(dá)到飽和，毒劑對(duì)酶的抑制在血腦屏障內(nèi)外達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡。同時(shí)，在重度染毒劑量下，毒劑消耗量占毒劑總劑量的28%，表明還有大量的毒劑并未參與反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，不同劑量下VX對(duì)中樞AChE活性的抑制率在染毒后48 h達(dá)最低值，在72 h均出現(xiàn)回升，這可能與染毒后毒劑在體內(nèi)某些組織中形成的神經(jīng)性毒劑“儲(chǔ)存庫”有關(guān)，隨著時(shí)間的延長，毒劑再次釋放進(jìn)入中樞［18］。

綜上所述，①VX染毒后中毒癥狀出現(xiàn)較慢；②從AChE活性抑制率時(shí)效關(guān)系分析得出，中樞和外周血AChE活性抑制率在染毒后48 h達(dá)最低值，在72 h均出現(xiàn)回升；③從被毒劑抑制的AChE量推算得知，VX的理論消耗量極低，最大消耗量約為0.5 nmol，即使在中毒癥狀達(dá)到重度的染毒劑量下，毒劑消耗量也僅占總?cè)径緞┝康?8%，而近72%的毒劑依然殘留在體內(nèi)，持續(xù)進(jìn)入中樞，并持續(xù)抑制AChE活性。結(jié)合上述規(guī)律，建議在VX中毒救治前期給予大量的重活化劑后，48 h內(nèi)再次給予抗神經(jīng)性毒劑藥物，用以清除體內(nèi)尚未與AChE結(jié)合的毒劑。