腎胺酶基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的相關(guān)性分析

汪 洋，孫 月，胡桂霖，鄒 婷，張曉玉，杜鳴飛，周浩偉，賈 昊，王 丹，張 婕，陳 晨，胡佳文，馬 瓊，袁 悅，廖月圓，王科科，嚴(yán) 瑜，張 璽，牛澤家馨，官永娟，閆睿晨，高 可，李 敏，牟建軍

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 西安市第四醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710004；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心外科，陜西西安 710061；4.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，陜西西安 710061)

高血壓因發(fā)病率高、伴發(fā)的血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)日益增加，已成為全球主要的健康挑戰(zhàn)[1-2]。高血壓是由多種遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用的結(jié)果[3]。在環(huán)境因素中，高鹽和低鉀攝入是高血壓重要的危險(xiǎn)因素[4]。高鹽和低鉀攝入與血壓升高有關(guān)[5-6]。然而，大量研究表明，高鹽或鉀攝入對(duì)血壓的影響存在個(gè)體差異，這種血壓對(duì)鹽或鉀敏感性的差異部分由于個(gè)體的遺傳易感性所致[7-8]。因此，識(shí)別血壓對(duì)鈉鉀反應(yīng)性的基因變異可以加深人們對(duì)血壓調(diào)節(jié)生理機(jī)制的理解，也有助于制定高血壓的防治措施。

腎胺酶是一種主要由腎臟合成和分泌的黃素蛋白，能夠代謝兒茶酚胺，調(diào)節(jié)機(jī)體血壓[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腎胺酶基因的變異與高血壓的發(fā)生關(guān)系密切。ZHAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人群中腎胺酶的編碼基因是原發(fā)性高血壓的一種新的易感基因，這種遺傳變異可能影響血壓水平。此外，也有研究報(bào)道，腎胺酶的基因多態(tài)性與血液透析患者、2型糖尿病患者的高血壓有關(guān)[11-12]。然而，以上研究均未考慮基因和環(huán)境的相互作用，尤其是高鹽或低鉀對(duì)血壓的影響，而這可能導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估基因在血壓變異中的作用。因此，本研究基于已建立的陜西“鹽敏感高血壓研究隊(duì)列”，通過(guò)對(duì)研究人群進(jìn)行鈉鉀飲食干預(yù)，探討腎胺酶基因的遺傳變異與血壓鈉鉀反應(yīng)性之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象2003年10月-2004年10月，參照鹽敏感性遺傳流行病學(xué)協(xié)作研究(GenSalt研究)方案，對(duì)陜西省眉縣多個(gè)農(nóng)村漢族人群進(jìn)行系統(tǒng)篩查，最終招募了來(lái)自126個(gè)家系的514名受試者建立陜西“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”。具體篩選標(biāo)準(zhǔn)已在本課題組既往的相關(guān)文獻(xiàn)中詳細(xì)報(bào)道[7,13-14]。

1.2 基線(xiàn)調(diào)查和飲食干預(yù)受試者進(jìn)行3天基線(xiàn)調(diào)查，包括問(wèn)卷調(diào)查、人體測(cè)量、血壓測(cè)量及血尿標(biāo)本收集。隨后對(duì)334名非父母者進(jìn)行為期3周的鈉鉀飲食干預(yù)：1周低鹽飲食，每天攝鹽3 g(相當(dāng)于每日51.3 mmol鈉)，早餐無(wú)鹽，午餐及晚餐各1.5 g；1周高鹽飲食，每天攝鹽18 g(相當(dāng)于每日307.8 mmol鈉)，早餐3 g，午餐及晚餐各7.5 g；1周高鹽補(bǔ)鉀飲食：在高鹽飲食的基礎(chǔ)上再攝入60 mmol(4.5 g)氯化鉀。具體干預(yù)操作流程參照本課題組既往研究[7,13-14]。

1.3 血壓測(cè)量基線(xiàn)期和飲食干預(yù)期的第5、6、7天采用隨機(jī)零點(diǎn)血壓計(jì)(Hawksley&Sons，英國(guó))進(jìn)行血壓測(cè)量，具體測(cè)量方法參照本課題組既往研究[7,15-16]。每一階段進(jìn)行3天血壓測(cè)量，將9次血壓的平均值納入最后的統(tǒng)計(jì)分析。在本研究中，將血壓對(duì)鈉鉀的反應(yīng)性看作連續(xù)性變量，具體分為低鹽期血壓反應(yīng)性、高鹽期血壓反應(yīng)性、補(bǔ)鉀期血壓反應(yīng)性。低鹽期血壓反應(yīng)性=低鹽期血壓-基線(xiàn)期血壓；高鹽期血壓反應(yīng)性=高鹽期血壓-低鹽期血壓；補(bǔ)鉀期血壓反應(yīng)性=高鹽補(bǔ)鉀期血壓-高鹽期血壓。

1.4 血液生化分析清晨空腹靜脈采4mL非抗凝血，離心機(jī)半徑16 cm，3 000 r/min 離心15 min，分離血清標(biāo)本于-80 ℃冷凍保存待測(cè)。采用Hitachi 7060全自動(dòng)生化分析儀(日立，日本)進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，具體內(nèi)容包括空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白等。

1.5 單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的選擇選擇美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)和基因組變異服務(wù)器數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gvs.gs.washington.edu/GVS147/)，采用HaploView 4.2軟件在中國(guó)北京漢族(CHB)和亞洲人群數(shù)據(jù)庫(kù)中按照以下標(biāo)準(zhǔn)篩選腎胺酶基因中的標(biāo)簽SNP位點(diǎn)：符合Hardy-Weinberg平衡定律(P≥0.05)，次要等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)P≥0.05，且r2≥0.8。最終納入10個(gè)腎胺酶基因相關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析：rs10509540、rs7922058、rs999951、rs10887800、rs796945, rs1935582、rs7076491、rs2296545、rs2576178及rs17109290。

1.6 基因分型采集每個(gè)受試者外周靜脈血，應(yīng)用GoldMag-Mini純化試劑盒純化外周血脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)。對(duì)2004年DNA標(biāo)本通過(guò)MassARRAY檢測(cè)平臺(tái)對(duì)腎胺酶基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。所有基因分型實(shí)驗(yàn)均由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

2結(jié) 果

2.1 受試者基線(xiàn)期的一般特征受試者平均年齡48.6歲，體質(zhì)量指數(shù)22.2 kg/m2，收縮壓115.2 mmHg，舒張壓71.3 mmHg，平均動(dòng)脈壓86.0 mmHg。高血壓患者共51人，占總?cè)藬?shù)的9.9%(表1)。

表1 受試者的一般特征

非正態(tài)分布計(jì)量資料：中位數(shù)(四分位數(shù)間距)。正態(tài)分布計(jì)量資料：均值±標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)數(shù)資料：個(gè)數(shù)(所占百分比)。高血壓判定標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓≥140 mmHg和或舒張壓≥90 mmHg，或目前正在使用降壓藥物治療。

2.2 鈉鉀干預(yù)對(duì)受試者24 h尿鈉和鉀排泄的影響各階段受試者尿鈉鉀排泄量如表2所示。24 h尿鈉排泄量在低鹽期較基線(xiàn)期明顯降低，高鹽負(fù)荷后明顯升高，補(bǔ)鉀能夠明顯升高24 h尿鉀排泄量，這提示飲食干預(yù)依存性較好。

表2 各階段受試者尿鈉鉀排泄量

2.3 受試者血壓的鈉鉀反應(yīng)性鈉鉀飲食干預(yù)時(shí)，各期血壓均發(fā)生變化，其中低鹽期血壓較基線(xiàn)水平降低，高鹽期血壓水平回升，而高鹽補(bǔ)鉀飲食時(shí)，與高鹽期相比，血壓水平再次出現(xiàn)下降(表3)。

2.4 腎胺酶基因SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布由于本研究以家系為基礎(chǔ)，故選取181名父母親受試者的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。如表4所示，各SNP位點(diǎn)基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示受試者所在群體是一個(gè)遺傳平衡的群體。

2.5 腎胺酶基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)分析

如表5所示，低鹽期rs2576178位點(diǎn)與收縮壓和平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性均呈相關(guān)性(收縮壓：β=-2.730，P=0.005；平均動(dòng)脈壓：β=-1.718，P=0.028)，rs17109290位點(diǎn)與舒張壓反應(yīng)性呈相關(guān)性(β=-1.608，P=0.031)。在高鹽期及高鹽補(bǔ)鉀期，所有腎胺酶基因SNP位點(diǎn)與血壓反應(yīng)性均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

表3 各干預(yù)期血壓反應(yīng)性

表4 腎胺酶基因各SNP位點(diǎn)的基本信息

表5 腎胺酶基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性

續(xù)表5

3 討 論

腎胺酶基因位于10號(hào)染色體q23.33，由9個(gè)外顯子共311 000對(duì)堿基構(gòu)成，編碼342個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為38 ku[17]。近期，有研究發(fā)現(xiàn)腎胺酶參與血壓調(diào)節(jié)，并與高血壓的發(fā)生關(guān)系密切，對(duì)腎臟5/6切除大鼠和腦卒中型高血壓大鼠皮下注射重組腎胺酶可產(chǎn)生明顯降壓作用[18]。單純皮下注射1.3 mg/kg腎胺酶與口服5 mg/kg依那普利24 h后產(chǎn)生同等降壓作用[19]。一項(xiàng)納入2 586名中國(guó)漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)，腎胺酶基因的SNP位點(diǎn)rs2576178和rs2296545與原發(fā)性高血壓密切相關(guān)。在調(diào)整多種混雜因素后，SNP位點(diǎn)與高血壓的發(fā)生仍呈相關(guān)性(rs2576178 GG：OR=1.58；rs2296545 CC：OR=1.61)[10]。STEC等[12]報(bào)道，透析狀態(tài)高血壓患者腎胺酶基因SNP 位點(diǎn)rs2576178和rs10887800的G等位基因頻率均與高血壓相關(guān)(rs2576178：OR=1.55；rs10887800：OR=1.76)。然而，以上研究均未考慮基因和環(huán)境的相互作用，尤其是高鹽或低鉀對(duì)血壓的影響，而這可能導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估基因在血壓變異中的作用。

血壓具有遺傳性，其中20%～50%的血壓變異性可能由遺傳因素所致[20]。既往研究表明，個(gè)體遺傳背景可能與鹽介導(dǎo)的血壓反應(yīng)性有關(guān)[7-8,21]。另外，GHOSH等[22]發(fā)現(xiàn)高鹽攝入可調(diào)控腎胺酶表達(dá)，他們給予Dahl鹽敏感(SS)大鼠8%高鹽飲食干預(yù)3周，發(fā)現(xiàn)循環(huán)和腎臟組織腎胺酶水平明顯降低，4周后幾乎無(wú)法檢測(cè)。DESIR等[23]也證實(shí)了上述結(jié)果。本課題組也發(fā)現(xiàn)，SS大鼠與SS-13BN大鼠腎臟腎胺酶的表達(dá)在高鹽飲食4周時(shí)明顯下降，且這一趨勢(shì)在SS大鼠中更為明顯[24]。上述研究表明，腎胺酶可能參與血壓的鹽敏感性的形成。本研究通過(guò)對(duì)陜西“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”進(jìn)行慢性鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀干預(yù)，首次發(fā)現(xiàn)腎胺酶基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2576178與收縮壓反應(yīng)性、平均動(dòng)脈壓低鹽期反應(yīng)性呈相關(guān)性。上述結(jié)果提示，腎胺酶基因可能參與血壓鹽敏感性的形成。

流行病學(xué)結(jié)果顯示，鉀攝入與血壓呈負(fù)相關(guān)。臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道，補(bǔ)鉀可降低高血壓和血壓正常個(gè)體的血壓水平，且補(bǔ)鉀的降壓效應(yīng)可能存在個(gè)體差異性[25-26]。GenSalt研究表明，在遺傳背景相似的中國(guó)漢族人群中，補(bǔ)鉀的血壓反應(yīng)仍不同，提示人群存在血壓的“鉀敏感性”[8,25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)，遺傳變異與補(bǔ)鉀的血壓反應(yīng)性相關(guān)。ZHAO等[25]報(bào)道漢族人群APLN和ACE2基因變異與補(bǔ)鉀的血壓反應(yīng)有關(guān)；此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)農(nóng)村人群血管內(nèi)皮通路包括內(nèi)皮素1(EDN1)、一氧化氮合酶3(NOS3)、E選擇素(SELE)等關(guān)鍵基因的多態(tài)性與補(bǔ)鉀血壓反應(yīng)性有關(guān)[26]。本研究首次探討腎胺酶基因多態(tài)性與補(bǔ)鉀的血壓反應(yīng)性的關(guān)系，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相關(guān)性。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)陜西“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”進(jìn)行鈉鉀飲食干預(yù)，發(fā)現(xiàn)腎胺酶基因多態(tài)性與血壓鈉反應(yīng)性相關(guān)，這有助于從遺傳角度進(jìn)一步理解鹽敏感性高血壓的形成機(jī)制并為其防治工作提供新思路。然而，本研究樣本量相對(duì)偏少，且局限于中國(guó)北方漢族人群，因此，研究結(jié)論尚需在其他大樣本人群中進(jìn)一步加以驗(yàn)證。