基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的羅布麻葉抗敗血癥作用及其機制研究

歐陽遠朔，王艷明，秦敘青，蔣 涵，劉魯倩，何文君，李新芝，馬克濤

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1. 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室；2. 國家衛(wèi)健委中亞高發(fā)病防治重點實驗室；3. 生理學(xué)教研室；4.病理生理學(xué)教研室，新疆石河子 832000)

敗血癥(sepsis)是指病原菌侵入血液循環(huán)，并在其中生長繁殖、產(chǎn)生毒素而造成的全身性炎癥反應(yīng)[1]。在臨床治療中，除了常規(guī)處理原發(fā)感染灶、補充血容量、控制高熱、糾正電解質(zhì)紊亂和維持酸堿平衡等治療手段外，抗菌藥物的應(yīng)用也是治療敗血癥的關(guān)鍵。近年來，隨著提純技術(shù)的改進，越來越多的證據(jù)表明一些中草藥可以通過多成分、多靶點、多機制發(fā)揮抗炎或抑菌作用，用于治療和預(yù)防敗血癥。有研究報道，科普蒂斯(Rhizoma, RC)是一種中國古典傳統(tǒng)藥草，其在治療敗血癥中表現(xiàn)出的抗炎和抗氧化特性可以通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)理論被揭示[2]。

羅布麻又名紅野麻，屬夾竹桃科，是一種生長在鹽堿、沙荒地區(qū)的草本植物，最初在新疆羅布泊發(fā)現(xiàn)。其廣泛分布于甘肅、吉林、青海、陜西、新疆、內(nèi)蒙古等省(自治區(qū))，其中以新疆塔里木河邊緣地區(qū)的羅布麻資源最為豐富。據(jù)不完全統(tǒng)計，羅布麻野生面積2 000多萬畝，其中新疆約800萬[3]。羅布麻富含黃酮、鞣質(zhì)、有機酸、醇類、甾體類等物質(zhì)，具有抗炎、抑菌、降血脂、抗抑郁、鎮(zhèn)靜、止咳、抗氧化等作用[4]。與許多中草藥一樣，羅布麻抗炎、抑菌的主要活性成分及作用機制尚不明確。因此，羅布麻抗敗血癥的潛在機制需要進一步探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于“藥物-靶點基因-疾病”的相互作用網(wǎng)絡(luò)，能系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的影響，整體揭示中草藥對機體產(chǎn)生作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和效應(yīng)機制，在闡明中草藥的藥理作用機制方面發(fā)揮了巨大的作用[5-6]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)分析手段，篩選出可靠的活性成分與核心靶基因，探討羅布麻葉抗敗血癥的作用機制，為羅布麻葉抗敗血癥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php)，有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/)，Genecarsd疾病基因數(shù)據(jù)庫(http://www. Genecards.org/)，STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)，Ensembl基因名稱轉(zhuǎn)換(www.ensembl.org/biomart/)，OmicShare服務(wù)器(http://www.omicshare.com/)，Cystoscape 3.6.0(http://www.cytoscape.org/)。

1.2 方法

1.2.1羅布麻葉有效成分的篩選中藥的化學(xué)物質(zhì)成分復(fù)雜，一般只有進入血液循環(huán)才能產(chǎn)生作用。通過裴媛等[7]的研究報道和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP數(shù)據(jù)庫)，共查詢得到羅布麻葉中的56個化學(xué)成分?？诜锢枚?OB)是藥物經(jīng)口服給藥后被機體吸收進入血液循環(huán)的相對量和速率，是藥物特性的主要藥動學(xué)參數(shù)之一。藥物相似性(DL)是指化合物與已知藥物的相似性，可作為該化合物與已上市藥物接近程度的一個指標(biāo)。根據(jù)研究方法設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18，在該條件下篩選出羅布麻葉治療心血管疾病的藥效成分。

1.2.2活性成分和敗血癥相關(guān)基因的獲取根據(jù)所篩選的活性成分，在PubChem中確定其化學(xué)式結(jié)構(gòu)，將化學(xué)式導(dǎo)入SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測分析。以“sepsis”為關(guān)鍵詞在Genecards疾病基因數(shù)據(jù)庫中篩選敗血癥的相關(guān)靶點。將化合物靶點與敗血癥靶點信息進行基因映射，獲得活性成分-敗血癥共同作用的靶基因，并繪制Veen圖。

1.2.3靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為研究羅布麻葉抗敗血癥靶蛋白之間的相互作用，用STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫構(gòu)建羅布麻葉抗敗血癥靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將1.2.2項中共有靶點導(dǎo)入平臺中，將物種設(shè)為“Homosapiens(人類)”。輸入113個共同作用靶點的基因名稱，單擊“submit”進行蛋白與蛋白之間的相互作用分析, 得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，整理網(wǎng)絡(luò)布局并保存圖片。

1.2.4可視化軟件核心基因的選取將蛋白相互作用文件所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，相互作用網(wǎng)絡(luò)連線的粗細表示相互作用力的強弱，靶點的度值(degree)表示相互作用的靶點個數(shù)，按度值大小排列，選取前6個靶基因作為核心基因進行研究。

1.2.5GO功能富集分析與KEGG通路富集分析將核心基因名稱轉(zhuǎn)為Ensembl基因名稱(www.ensembl.org/biomart/)，啟動OmicShare服務(wù)器，依次點擊“我的軟件”、基因本體論(GO)動態(tài)富集分析、京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)動態(tài)富集分析，輸入轉(zhuǎn)換好的Ensembol基因名稱，獲取GO與KEGG動態(tài)富集結(jié)果。GO可以表示細胞內(nèi)的細胞組分、分子功能及生物學(xué)過程，KEGG包含的通路數(shù)據(jù)庫儲存了基因功能的相關(guān)信息。

1.2.6構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-GO-KEGG”網(wǎng)絡(luò)采用Cystoscape 3.6.1軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析及可視化工作，以羅布麻葉篩選出的4個活性成分對應(yīng)的6個靶標(biāo)及GO與KEGG數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在網(wǎng)絡(luò)中，以節(jié)點(node)表示藥物、活性成分、靶點、GO、KEGG。以邊表示藥物、活性成分、靶點、通路等的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 羅布麻葉治療心血管疾病藥效成分的篩選情況羅布麻葉的主要活性成分為黃酮類、甾醇類等，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共得到羅布麻葉有效藥效成分4個，分別為山柰酚、木犀草素、原花青素B1和谷甾醇，這4個成分被認(rèn)為是可靠的抗敗血癥活性成分(表1)。

表1 羅布麻葉治療敗血癥的4個活性化合物

2.2 羅布麻葉抗敗血癥靶點的篩選結(jié)果將得到的4個活性成分經(jīng)過有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem轉(zhuǎn)化為化學(xué)式，將化學(xué)式輸入SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫分析了羅布麻葉的4個主要化學(xué)成分，共預(yù)測得到了255個潛在藥物靶點，并與Genecards數(shù)據(jù)庫篩選出的2 497個敗血癥疾病靶點比對，得到113個共有靶點直接或間接與敗血癥有關(guān)(圖1)。

圖1 通過維恩圖和PPI網(wǎng)絡(luò)確定了羅布麻葉對膿毒癥作用的共有基因

2.3 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建情況將篩選得到的羅布麻葉治療膿毒癥的共有靶點導(dǎo)入STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫中，探討這些靶點之間的相互作用關(guān)系，并篩選主要靶點。將從STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫中得到的靶點相互作用信息導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型(圖2)，利用度值篩選出AKT1、VEGFA、MAPK3、EGFR、SRC、PTGS2 6個靶基因(表2)。

表2 羅布麻葉治療敗血癥的6個靶基因度值

2.4 GO動態(tài)富集分析結(jié)果通過Omicshare服務(wù)器獲得6個核心靶點的GO動態(tài)富集分析結(jié)果氣泡圖(圖3～圖5)。GO富集分析包括細胞組分分析、生物過程分析、分子功能分析。細胞組分分析結(jié)果顯示，細胞器包膜、內(nèi)部囊腔、細胞內(nèi)囊泡、Shc-EGFR復(fù)合體、海綿體、突觸傳遞、質(zhì)膜運輸?shù)汝P(guān)系密切。生物過程分析結(jié)果表明，表皮生長因子的激活，前列腺素-過氧化物合酶、蛋白二聚體的活性，碳水化合物的代謝，蛋白激酶C、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、一氧化氮合酶的活性，以及骨架蛋白、整聯(lián)蛋白、ATP、陰離子的結(jié)合等，可能參與到羅布麻葉抗敗血癥的機制中。分子功能分析結(jié)果顯示，細胞對機械刺激、酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)，肽基絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化修飾和正向調(diào)控，細胞組分改變和細胞遷移的正向調(diào)節(jié)，以及凋亡過程中的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控等，可能對羅布麻葉抗敗血癥的機制產(chǎn)生一定影響。

圖3 細胞組分分析

圖4 生物過程分析

圖5 分子功能分析

2.5 KEGG動態(tài)富集分析結(jié)果通過Omicshare服務(wù)器獲得6個核心靶點KEGG動態(tài)富集分析結(jié)果氣泡圖(圖6、圖7)，共得到q-value值前20條的KEGG通路，通路之間聯(lián)系密切，且每條通路均有多個靶點富集(圖6)。其中VEGF、ErbB、HIF-1、Ras信號通路與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，EGFR酪氨酸激酶抑制劑、Rap1信號通路、內(nèi)分泌抗性與耐藥性有關(guān)，人巨細胞病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒、人乳頭瘤病毒與感染密切相關(guān)，子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、胰腺癌、蛋白聚糖在癌癥過程中均有聯(lián)系，C型凝集素受體信號與免疫系統(tǒng)有關(guān)，癌灶黏附與細胞群體中真核生物有關(guān)，松弛素信號、雌激素信號、催產(chǎn)素信號等相關(guān)通路與內(nèi)分泌系統(tǒng)有一定聯(lián)系。結(jié)果表明，羅布麻葉中的有效活性成分可能通過作用于上述通路調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，抑制病毒感染和腫瘤形成，影響炎癥反應(yīng)和激素水平，恢復(fù)免疫功能等途徑，達到治療效果(圖7)。

圖6 KEGG動態(tài)富集分析

2.6 羅布麻葉抗敗血癥的“藥-活性成分-靶點-GO-KEGG”網(wǎng)絡(luò)采用Cytoscape 3.6.0軟件建立“羅布麻葉-藥效成分-靶點-GO-通路”網(wǎng)絡(luò)模型。羅布麻葉4種活性成分、6個靶點和GO生物過程前20的功能與KEGG前20的通路之間的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖5)。由網(wǎng)絡(luò)圖可看出，羅布麻葉中的同一活性成分可以作用于多個靶點，同一靶點也可作用于多個活性成分，同時，同一靶點又參與到多條通路中，而一條通路又會富集多個靶點，從而形成一個層層相連的多成分-多靶點-多通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終發(fā)揮抗敗血癥的效果。

圖7 KEGG通路分類

圖8 來自生物信息學(xué)分析的網(wǎng)絡(luò)可視化，構(gòu)建了羅布麻葉-活性成分-靶點-GO-KEGG-敗血癥的相互作用關(guān)系圖

3 討 論

敗血癥是與感染相關(guān)的主要死亡原因，是醫(yī)療保健的重點。敗血癥的潛在臨床發(fā)病機制包括氧化應(yīng)激、免疫功能障礙和炎癥浸潤[8]。在敗血癥的早期，過度的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致免疫功能障礙，使患者容易繼發(fā)感染。由于膿毒癥的發(fā)病機制與免疫功能障礙、炎性應(yīng)激有關(guān)，因此具有抗炎活性的潛在藥物應(yīng)針對這些過程發(fā)揮作用[9]。臨床研究表明，使用羅布麻葉可以降低感染風(fēng)險，其中包括與人類敗血癥相關(guān)的風(fēng)險[10]。但是，羅布麻葉的抗炎機制尚未明確。在本研究篩選出的活性成分中，有報道稱，山柰酚和5,7-二羥黃酮協(xié)同作用可以提高敗血癥小鼠的存活率[11-12]，木犀草素可以激活 ERK1/2和Ca2+-依賴HO-1誘導(dǎo)，減少RAW264.7細胞中LPS誘導(dǎo)的HMGB1、iNOS/NO和COX-2表達，并減輕內(nèi)毒素小鼠的急性肺損傷[13]。另外有文獻報道，隨著Nrf2核轉(zhuǎn)移，原花青素B2可以治療敗血癥引發(fā)的急性腎損傷。本研究使用系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來鑒定和優(yōu)化針對敗血癥的羅布麻葉作用的生物靶標(biāo)、功能過程和分子途徑的篩選是一種有吸引力的研究方法[14]。使用這種有潛力的生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)地獲得了針對敗血癥的羅布麻葉作用的所有潛在生物靶標(biāo)，并將潛在的核心藥理學(xué)靶標(biāo)鑒定為AKT1、VEGFA、MAPK3、EGFR、SRC、PTGS2。有文獻報道，Akt/FOXO信號通路在嚙齒動物骨骼肌敗血癥導(dǎo)致的蛋白質(zhì)損失和肌肉碳水化合物氧化損傷中發(fā)揮潛在作用[15]。另外，敗血癥中血管生成素-2和VEGFA的協(xié)同藥理抑制作用也有報道[16]。敗血性休克兒童的生物信息學(xué)分析確定的關(guān)鍵基因之一是MAPK3[17]。EGFR的活化可防止腸道居民致病性大腸桿菌在晚發(fā)性新生兒敗血癥模型中轉(zhuǎn)移[18]。還有研究報道，通過調(diào)節(jié)SRC的激活，可以使敗血癥的超敏炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)啟動[19]。PTGS2又稱環(huán)氧酶-2(Cox-2)，能夠作為NF-kb下游分子在敗血癥過程中被有效激活[20]。在機制方面，羅布麻葉通過NF-kb通路對人類U87膠質(zhì)瘤細胞的凋亡有誘導(dǎo)作用[21]；羅布麻葉提取物通過AMPK/mTOR通路抑制大鼠動脈硬化的進展[22]，通過Src/PI3K/Akt信號通路發(fā)揮內(nèi)皮依賴性松弛作用[23]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究羅布麻葉抗敗血癥的機制，闡述了多靶點與多成分間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系，為進一步系統(tǒng)地開展羅布麻葉抗敗血癥的實驗研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。但是，本研究仍存在一些不足，尚未考慮藥物劑量及有效成分提取方法對抗敗血癥療效的影響，同時活性成分及靶點富集結(jié)果分析有一定的局限性，需要分子學(xué)的實驗進行驗證。因此，本課題組將進一步通過細胞體外實驗與動物體內(nèi)實驗驗證靶點對抗敗血癥的實際效果，為羅布麻葉抗敗血癥的藥物開發(fā)提供一定的實驗依據(jù)[24-25]。