網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)丹紅有效組分配伍抗缺血性腦卒中的作用機(jī)制及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究

朱慧淵，苗 琦，王 江，羅 斌，萬海同，王文瑄，董炳耀，肖生斌，黨 珊

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712046；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州 310053；3. 西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院疼痛科，陜西西安 710068；4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，陜西西安 710061；5. 陜西省人民醫(yī)院老年病科，陜西西安 710068)

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke, CIS)在腦血管疾病中占有重要地位，具有發(fā)病率高、致殘率高和致死率高的特點(diǎn)[1]，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。CIS歸屬于中醫(yī)“腦中風(fēng)”范疇，血瘀為中風(fēng)病發(fā)生的病理因素之一，氣與血關(guān)系密切，瘀血的形成導(dǎo)致氣機(jī)升降失調(diào)，氣血逆亂，上沖于腦，出現(xiàn)猝然昏倒、肢體偏癱等癥狀。

基于急則治其標(biāo)的原則，應(yīng)當(dāng)采用活血化瘀法。丹參-紅花作為常用的活血化瘀藥對(duì)，治療缺血性腦卒中有顯著的療效，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用，中藥制劑丹參注射液在臨床上被廣泛使用[2]。

《中國藥典》(2015年版)記載丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效；紅花(Carthamus tinctorius. L)味辛，溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛等功效。丹參、紅花常配伍使用，協(xié)同增效。目前丹參-紅花藥對(duì)配伍抗CIS的作用機(jī)制、靶點(diǎn)尚不明確，需進(jìn)一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于系統(tǒng)生物學(xué)理論的新學(xué)科[3]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選丹參-紅花配伍抗CIS的成分靶點(diǎn)、作用靶點(diǎn)，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證丹參-紅花有效成分配伍抗炎癥損傷的作用機(jī)制，以期為后續(xù)丹紅配伍防治CIS的臨床合理用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丹參-紅花有效成分及成分靶點(diǎn)的收集利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以“丹參”“紅花”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以口服利用度(oral bioavailability, OB)>30%、類藥性(drug-likeness, DL)>0.18作為篩選條件[4]，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名，以便網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.2 丹參-紅花化學(xué)成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫將丹紅共同靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入，通過系統(tǒng)蛋白分析得到PPI圖，并對(duì)蛋白之間作用進(jìn)行打分，分值越高，作用越密切。

1.3 丹參-紅花化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建Cytoscape是一款網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的編輯和分析軟件，由節(jié)點(diǎn)(nodes)和邊(edges)組成可視化網(wǎng)絡(luò)圖[5]。利用軟件Cytoscape 3.8.0對(duì)丹參-紅花藥對(duì)進(jìn)行化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.4 CIS相關(guān)靶點(diǎn)的收集利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行疾病靶點(diǎn)檢索，將結(jié)果導(dǎo)入Excel。GeneCards是生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，自動(dòng)集成來自約150個(gè)網(wǎng)絡(luò)來源的以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳、臨床和功能信息。

1.5 丹參-紅花對(duì)CIS作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用Venny2.1.0在線分析工具，將丹參-紅花藥對(duì)有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到161個(gè)共同蛋白，并導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，將結(jié)果下載并運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建PPI圖。

1.6 丹參-紅花治療CIS作用靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析將丹參-紅花對(duì)疾病的作用靶點(diǎn)上傳至David 6.8數(shù)據(jù)庫，在分析結(jié)果中依次選擇BP、MF、CC和KEGG，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)出。利用omicshare在線網(wǎng)站將KEGG數(shù)據(jù)制作成氣泡圖。

1.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(280±30)g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(浙)2014-0001。

1.8 主要試劑與儀器NFkBp65(F-6)兔來源克隆抗體購自Santa Cruz公司，試劑稀釋比為 1∶120，批號(hào)為#F0815；NLRP3炎癥小體兔來源克隆抗體購自NOVUS公司，稀釋比為1∶50，批號(hào)為08063965C-07；mouse和rabbit來源一抗的組化試劑盒、免疫組化檢測(cè)試劑盒EnVisionTM Two-Step購自丹麥DAKO公司，批號(hào)為1701777A；Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary antibody購自Thermo Pierce NO公司，試劑稀釋比為1∶5 000，貨號(hào)為31210。MICROM HM340E石蠟切片機(jī)購自德國MICROM公司，OLYMPUS BX60型熒光顯微鏡攝像機(jī)購自日本OLYMPUS公司，紫外分光光度計(jì)購自美國Beckman公司，低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，Leica HI120型攤片機(jī)購自德國Leica公司，Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.9 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備將大鼠隨機(jī)分為4組(假手術(shù)組、模型組、丹紅有效組分配伍組和尼莫地平組)，每組8只。模型制備按照LONGA[6]改良方法復(fù)制大腦中動(dòng)脈局灶性栓塞(MCAO)。麻醉大鼠后將其固定，切開頸正中部，暴露右頸總動(dòng)脈(CCA)，頸內(nèi)、外動(dòng)脈(ICA、 ECA)，以及右側(cè)頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈分支；結(jié)扎并剪斷ECA分支，動(dòng)脈夾阻斷CCA，距其分叉0.8～1.0 cm處絲線結(jié)扎ECA，并在其近心端剪一切口，插入尼龍線作為標(biāo)記。經(jīng)分叉處輕輕插入ICA，當(dāng)將尼龍線插入距CCA分叉2.0 cm左右有阻力，證明已插至Willie’s環(huán)大腦前動(dòng)脈起始處；結(jié)扎ECA。1 h缺血后抽出線栓進(jìn)行再灌注，緊扎切口，逐層縫合。假手術(shù)組除不插入線栓外，其余同上。大鼠醒后若表現(xiàn)為同側(cè)Horner征及以前肢為重的對(duì)側(cè)偏癱，表明造模成功[7]。假手術(shù)組及模型組分別灌服等體積生理鹽水(2 mg/kg)。丹紅有效組分配伍組(720 mg/kg)(按照以往丹紅配伍組的篩選結(jié)果[8]；選取最佳配伍比例：丹參酮240 mg/kg、丹參素320 mg/kg、丹酚酸120 mg/kg、羥基紅花黃色素40 mg/kg)及尼莫地平組(0.5 mg/kg)用生理鹽水配成混懸液，于再灌0、6 h，各灌胃給藥1次。

1.10 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦組織NLRP3炎癥小體和NFkBp65蛋白的相對(duì)表達(dá)病理切片進(jìn)行脫蠟、水化、沖洗，滴加DAB顯色液，顯微鏡控制顯色，1 min后結(jié)束反應(yīng)。用Harris蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核后，將切片脫水至透明，晾干，中性樹膠封片。

采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量NLRP3炎癥小體和NFkBp65的陽性表達(dá)：在200倍視野下選擇3～5個(gè)皮層梗死缺血灶，使用Image-ProPlus 5.0圖像分析軟件測(cè)量陽性細(xì)胞mean density值，并整理分析數(shù)據(jù)。

1.11 Real-time PCR檢測(cè)大鼠腦組織NLRP3炎癥小體和NFkBp65基因的相對(duì)表達(dá)提取腦組織總RNA，使用Primer Premier 6.0及Beacon Designer 7.8進(jìn)行處理，設(shè)計(jì)定量PCR引物，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，然后將循環(huán)程序設(shè)定為95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s共重復(fù)40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熔解度曲線。設(shè)計(jì)的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。每個(gè)樣品重復(fù)3次，每個(gè)基因的相對(duì)陽性表達(dá)均采用2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 丹參-紅花有效成分及成分靶點(diǎn)的收集與篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到丹參有效成分65個(gè)，紅花有效成分22個(gè)，丹參、紅花共有化合物3個(gè)。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，羥基紅花黃色素A和紅花黃色素對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用，因此也將其記入其中[9]。去掉重復(fù)化合物后共得到86個(gè)化合物。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行成分靶點(diǎn)的收集，共計(jì)有靶點(diǎn)的化合物73個(gè)，對(duì)應(yīng)的成分靶點(diǎn)共253個(gè)。其中丹參-紅花的共同成分為poriferast-5-en-3beta-ol、Baicalin(黃芩苷)和luteolin(木犀草素)(表1)。

2.2 丹參-紅花化學(xué)成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建情況將丹參、紅花106個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖。在成分靶點(diǎn)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖中，共有節(jié)點(diǎn)103個(gè)，邊1 202條，平均節(jié)點(diǎn)度為23.3。其中，節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的關(guān)系，邊的粗細(xì)程度代表蛋白之間的關(guān)聯(lián)程度，邊越粗，蛋白之間相互作用越緊密(圖1)。

表1 丹參-紅花共同有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目

圖1 丹參-紅花成分靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 丹參-紅花化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建情況依據(jù)丹參、紅花的化合物及其靶點(diǎn)數(shù)據(jù)分別建立network文件和type文件，并依次導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，繪制成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，共得到節(jié)點(diǎn)328個(gè)，邊1 457條。將成分及成分靶點(diǎn)進(jìn)行度值(Degree)分析，選取Degree排名前10的數(shù)據(jù)，其中quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)和kaempferol(山柰酚)度值較高，成分靶點(diǎn)中前列腺素內(nèi)過氧化物含酶基因(PTGS2)度值較高(圖2，表2)。

2.4 丹參-紅花對(duì)CIS的作用靶點(diǎn)利用數(shù)據(jù)庫檢索到丹參-紅花化合物對(duì)應(yīng)253個(gè)靶點(diǎn)，疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 448個(gè)。藥物與疾病共得到161個(gè)交集靶點(diǎn)(圖3)。

表2 成分及成分靶點(diǎn)度值

圖2 丹參-紅花主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.5 丹參-紅花對(duì)CIS作用靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)藥物-疾病共同靶點(diǎn)161個(gè)，導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，進(jìn)行蛋白相互作用分析，得到161個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 414條邊。蛋白相互作用程度排名前10的基因分別為蛋白激酶 (AKT1)、白蛋白(ALB)、白介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、腫瘤蛋白p53(TP53)、腫瘤壞死因子(TNF)、胱冬酶3(CASP3)、細(xì)胞癌基因(FOS)、蘇氨酸蛋白激酶(MAPK1)和表皮生長因子(EGF)(圖4)。

2.6 丹參-紅花治療CIS作用靶點(diǎn)的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫的GO富集分析功能，得到730個(gè)生物學(xué)過程，包括藥物反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)雌二醇和乙醇的反應(yīng)、DNA轉(zhuǎn)錄和調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控等，預(yù)測(cè)這些生物過程可能與丹紅治療CIS有關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，丹參-紅花作用于CIS的通路有127條，其中包括炎癥信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等(圖5、圖6)。

2.7 丹紅有效組分配伍抗CIS炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制

2.7.1對(duì)大鼠腦組織NLRP3炎癥小體和NFkBp65蛋白相對(duì)表達(dá)的影響 免疫組化法顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織NFkBp65、NLRP3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.001)；與模型組比較，丹紅配伍組和尼莫地平組NFkBp65、NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.001，表3，圖7、圖8)。

2.7.2對(duì)大鼠腦組織NLRP3炎癥小體和NFkBp65基因相對(duì)表達(dá)的影響 Real-time PCR測(cè)定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組NLRP3炎癥小體和NFkBp65基因表達(dá)明顯升高(P<0.001)；與模型組比較，丹紅配伍組和尼莫地平組NFkBp65、NLRP3基因表達(dá)明顯降低(P<0.001，表4)。

圖4 丹參-紅花對(duì)CIS作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖5 丹參-紅花對(duì)CIS作用靶點(diǎn)的GO富集分析

圖6 丹參-紅花對(duì)CIS作用靶點(diǎn)的KEGG分析的氣泡圖

表3 丹紅有效組分配伍對(duì)腦組織致炎因子NFkBp65、NLRP3表達(dá)的影響

表4 丹紅有效組分配伍對(duì)腦組織致炎因子NFkBp65、NLRP3表達(dá)的影響

圖7 丹紅有效組分配伍對(duì)大鼠腦組織NFkBp65蛋白表達(dá)的影響(免疫組化，×200)

圖8 丹紅有效組分配伍對(duì)大鼠腦組織NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)的影響(免疫組化，×200)

3 討 論

CIS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有多因素、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)與炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸的毒性作用、鈣離子超載等病理反應(yīng)有關(guān)[10]。針對(duì)以上病理機(jī)制，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用外科手術(shù)聯(lián)合抗炎、抗凝血、溶栓和神經(jīng)保護(hù)等藥物對(duì)癥治療[10]，在一定程度上降低了疾病的病死率，但對(duì)應(yīng)的治療藥物有一定程度的不良反應(yīng)。中醫(yī)藥具有安全性高、療效穩(wěn)定和毒性不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，在治療疾病過程中發(fā)揮的作用越來越顯著。

丹參-紅花作為活血化瘀的常用藥對(duì)，在治療氣滯血瘀型腦卒中方面發(fā)揮較好的療效。以往研究表明，丹紅注射液能夠改善腦缺血再灌注大鼠的血管內(nèi)皮功能，并降低炎癥損傷[11]，在臨床應(yīng)用較為廣泛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參活性成分具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)、改善微循環(huán)等作用[12]；紅花有效成分具有抗凝、穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)鈣離子、保護(hù)神經(jīng)元等作用[13]。本研究結(jié)果顯示，丹參-紅花共同化合物有3種，其中Baicalin(黃芩苷)具有抑制炎性因子表達(dá)、提高抗氧化能力、抑制細(xì)胞凋亡的作用[14]；luteolin(木犀草素)亦有多種藥理作用，有研究證實(shí)，木犀草素能夠抗腦缺血損傷，通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、影響能量代謝等方面發(fā)揮作用[15]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖分析，結(jié)果顯示，丹參、紅花有效組分配伍作用于缺血性腦卒中的重要靶點(diǎn)包括蛋白激酶(AKT1)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、NLRP3、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)等162個(gè)。AKT1是PI3-K/Akt信號(hào)通路下游的關(guān)鍵因子，PI3-K/Akt信號(hào)通路是腦缺血后細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要信號(hào)通路之一[16]。研究表明，通過激活PI3-K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)Akt1磷酸化，促進(jìn)血管新生，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，能夠減輕腦缺血再灌注大鼠損傷[17]。IL-1、IL-6是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)重要細(xì)胞因子，腦缺血發(fā)生后，機(jī)體釋放大量炎性因子參與免疫應(yīng)答，同時(shí)這些炎性細(xì)胞釋放氧自由基、細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)加重腦缺血[18]。NLRP3是一種多蛋白復(fù)合體，能通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)識(shí)別損傷信號(hào)，通過活化半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1) 誘導(dǎo)促炎因子 IL-1β和IL-18的釋放，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[19]。機(jī)體一般情況下，NLRP3炎癥小體處于靜息狀態(tài)，檢測(cè)數(shù)值的水平極低；當(dāng)腦組織缺血缺氧后，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子NFkB被激活，啟動(dòng)NLRP3、IL-1、IL-8等相關(guān)炎性因子的轉(zhuǎn)錄，參與損傷后的炎癥反應(yīng)[20]。以往實(shí)驗(yàn)研究證明，NLRP3炎癥小體參與腦缺血小鼠模型的炎癥損傷環(huán)節(jié)，其中的作用機(jī)制可能是促進(jìn)炎性因子的釋放，最終造成腦神經(jīng)元凋亡來實(shí)現(xiàn)[21]。因此，抑制NFkB信號(hào)通路的激活，減少炎癥小體的釋放，從而起到抗炎作用，最終實(shí)現(xiàn)減輕腦缺血損傷的臨床癥狀。VEGFA是腦缺血損傷后重要的調(diào)控因子，可以促進(jìn)血管生成，恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，起到保護(hù)神經(jīng)元、減輕腦缺血損傷的作用[22]。

此外，通過生物富集GO和KEGG分析，結(jié)果顯示，丹參-紅花治療CIS涉及多種生物過程及多個(gè)信號(hào)通路，其中，相關(guān)性較高的包括TNF、HIF-1、NFkB、PI3K-Akt信號(hào)通路等，主要在抗炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管內(nèi)皮生成、抑制細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。CIS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)在腦缺血發(fā)病進(jìn)程中占有重要地位。NFkB作為炎癥反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，其過度活化在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并與多種疾病均有關(guān)聯(lián)，可以啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)[23]。因此，臨床具有抗炎功效的藥物主要是通過抑制NFkB的活化達(dá)到減輕炎癥損傷的作用。以往研究顯示，腦缺血缺氧后產(chǎn)生不同類型的黏附分子，這些黏附分子分別與NFkB有對(duì)應(yīng)的結(jié)合靶點(diǎn)，NFkB信號(hào)通路激活，造成細(xì)胞因子過度釋放，進(jìn)而機(jī)體的炎癥反應(yīng)作用顯現(xiàn)[24]。NFkB與其他通路之間亦有相互作用。研究表明，NFkB參與TNFα信號(hào)通路，TNF家族的細(xì)胞因子通過激活NFkB信號(hào)通路，調(diào)控炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的增殖分化[25]。NFkB與PI3K-Akt之間也有關(guān)聯(lián)作用。研究發(fā)現(xiàn)，PI3-Akt信號(hào)通路與NFkB信號(hào)通路可以發(fā)生交互作用，PI3K信號(hào)通路激活后，促使Akt磷酸化，進(jìn)而影響炎癥通路NFkB的激活，引起后續(xù)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[26]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)，課題組考慮通過丹紅有效組分配伍干預(yù)抑制NFkB及其相關(guān)通路的激活，減輕腦組織細(xì)胞損傷癥狀，提高臨床防治缺血性腦病的治療效果。一般情況下，NLRP3炎癥小體處于靜息狀態(tài)，檢測(cè)數(shù)值水平極低，受到雙信號(hào)模式的刺激下能夠被激活，其中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子NFkB激活后，啟動(dòng)NLRP3、IL-1、IL-8等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)其表達(dá)水平，參與炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使神經(jīng)元凋亡，加重腦損傷程度[27]。研究結(jié)果證實(shí)，丹紅有效組分配伍能夠通過NFkB信號(hào)通路下調(diào)NLRP3炎癥小體的釋放，阻斷炎癥損傷環(huán)節(jié)，達(dá)到抗腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)及相關(guān)研究驗(yàn)證，丹紅有效組分配伍能夠通過調(diào)控NFkB炎癥信號(hào)通路，減少NLRP3炎性小體的陽性表達(dá)，從而達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。此外，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選，發(fā)現(xiàn)丹參-紅花有效組分可以通過調(diào)控多靶點(diǎn)、多個(gè)信號(hào)通路，發(fā)揮抗缺血性腦損傷的保護(hù)作用。今后將進(jìn)一步開展其他作用靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為后續(xù)臨床合理用藥提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。