胞裂蛋白12基因啟動子多態(tài)性與漢族男性弱精子癥易感性的關(guān)系分析

王海旭 張建芳 王紅娜 翟倩 李硯

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，陜西 西安 710032)

近年來不孕不育的發(fā)病率不斷增長[1]，世界衛(wèi)生組織報道[2]指出，中國不孕不育夫婦至少有1 000萬對，其中男性因素導(dǎo)致的不育占不孕不育夫婦的50%。弱精子癥是男性不育最常見的病因，臨床特征以精子活力異常、前向運動能力減弱為主，引起弱精子癥的病因多種多樣，但具體發(fā)病機(jī)制尚未有統(tǒng)一定論[3]。研究表明[4]，Septin(SEPT)是一類具有GTP 酶活性的細(xì)胞骨架基因家族，SEPT12基因是SEPT家族的成員之一，位于16 p13.3，在精子發(fā)生和成熟中發(fā)揮著重要作用。動物實驗研究[5]表明，SEPT12轉(zhuǎn)錄物缺失是造成雄性小鼠不育的重要因素，同時發(fā)現(xiàn)SEPT12在弱精子癥患者精子中顯著低表達(dá)。本研究主要通過調(diào)查弱精子癥患者精液標(biāo)本中SEPT12基因表達(dá)水平，探討SEPT12基因多態(tài)性與弱精子癥易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2018年3月至2020年3月期間于我院就診的弱精子癥患者230例為弱精子癥組，入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)按照第五版WHO公布的精液常規(guī)分析確診為弱精子癥；(2)常住西安的漢族人群；(3)就診前無高熱現(xiàn)象。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并重度精索靜脈曲張者；(2)染色體核型異常；(3)Y染色體AZF微缺失；(4)睪丸炎、生殖器外傷者。另選取同期采集的正常精液標(biāo)本為對照組(n=200)。本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 患者采集標(biāo)本前需禁欲3～7 d，確保所有精液完全射入取精杯中，37℃恒溫水箱中水浴30 min，完全液化后，經(jīng)40%和80%Percoll非連續(xù)密度梯度液分離，取80%Percoll液底部的精子，離心分離純化精子后，置于-80℃冰箱中保存待測。取出標(biāo)本置于冰上溶解，提取RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)逆錄成cDNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測精子SEPT12基因表達(dá)，針對SEPT12基因rs759991 位點設(shè)計特異性引物，引物序列上游5’-GTACAAAGTACACGCAGCAGTGC’，下游5’-ATCACCCGCCAGCGCCACAT’，交由上海生工生物工程有限公司合成后，待反應(yīng)完成后送往公司進(jìn)行測序。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床資料比較 弱精子癥組前向運動精子百分率明顯低于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2SEPT12基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 兩組SEPT12各基因型頻率分布無顯著差異(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。見表2。

表2 SEPT12基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗[n(%)]

2.3SEPT12基因rs759991位點基因型的分布頻率 弱精子癥組SEPT12基因rs759991位點TT基因型頻率高于對照組(P<0.05)，CC、CT基因型在兩組間的分布頻率無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 SEPT12基因rs759991位點基因型的分布頻率[n(%)]

2.4SEPT12基因rs759991 位點等位基因頻率 弱精子癥組C等位基因頻率明顯低于對照組，T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 SEPT12基因rs759991位點等位基因頻率[n(%)]

3 討 論

近年來多數(shù)學(xué)者提出某些遺傳基因的突變是引發(fā)弱精子癥的重要致病因素，有研究[6]表明，單核苷酸多態(tài)性在疾病的遺傳機(jī)理中發(fā)揮著重要作用，會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平產(chǎn)生一定影響。Septins是一個聚合GTP結(jié)合蛋白家族，定位于精子鞭毛環(huán)結(jié)構(gòu)，精子尾部鞭毛(sperm flagella)是保障精子維持活力的主體結(jié)構(gòu)[7]。SEPT12基因?qū)儆赟EPT家族成員，而SEPT12基因rs759991位點位于該基因第5號外顯子。哺乳動物中精子向前運動主要靠精子尾部鞭毛擺動，任何精子尾部的形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常均會導(dǎo)致精子運動障礙、精子活力改變，Y.H.Lin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SEPT12基因rs759991位點TT基因型個體的精子頸環(huán)和尾部結(jié)構(gòu)存在異常，精子DNA損傷明顯增加，提示SEPT12基因rs759991位點多態(tài)性與男性不育存在相關(guān)性。Y.R.Shen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SEPT12Ser198位于保守的G結(jié)構(gòu)域中，采用Ser198磷酸化通過消除SEPT12與SEPT17的關(guān)聯(lián)進(jìn)而破壞SEPT12細(xì)絲，導(dǎo)致精子環(huán)的缺失、結(jié)構(gòu)異常和活性下降。相關(guān)序列分析結(jié)果顯示[10]，rs759991位點C/T的改變會增加一個新的剪接點，進(jìn)而導(dǎo)致5號外顯子3’端41lb的缺失同時在6號外顯子出現(xiàn)一個新的的密碼子，出現(xiàn)一種C末端缺失的SEPT12蛋白，GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失，影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響精子活力。

本研究結(jié)果顯示，弱精子癥組SEPT12基因 rs759991 位點TT基因型頻率高于對照組；弱精子癥組T等位基因頻率高于對照組，分析原因可能是SEPT12基因 rs759991 位點TT基因型個體的精子頸環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加DNA損傷程度，影響線粒體分布和數(shù)量，而線粒體是為精子提供三磷酸腺苷的重要前提，進(jìn)而影響精子活力，造成弱精子癥的發(fā)生。

綜上所述，SEPT12基因 rs759991 位點與漢族男性弱精子癥的發(fā)生存在相關(guān)性，攜帶TT基因型的個體可能會增加弱精子癥的患病風(fēng)險，值得進(jìn)一步深入探討其作用和調(diào)控機(jī)制。