不同溶液浸泡后北柴胡種子中香豆素含量的測(cè)定

劉計(jì)權(quán)，王 宇，劉 昕，賀潤(rùn)麗

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西晉中030619）

中藥柴胡來(lái)源于傘形科植物柴胡Bupleurum Chinese DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，按性狀、產(chǎn)地的不同，前者習(xí)稱為“北柴胡”，后者習(xí)稱為“南柴胡”。柴胡具有解表和里、升陽(yáng)、疏肝解郁、調(diào)經(jīng)等作用，主治感冒、上呼吸道感染、瘧疾、寒熱往來(lái)、肋痛、肝炎、膽道感染、膽囊炎、月經(jīng)不調(diào)等［1］。以柴胡為原料的中成藥多達(dá)數(shù)十種，如復(fù)方柴胡注射液、熱痛寧注射液、和解散、逍遙丸、逍遙合劑、肝得生丸等，新藥發(fā)展迅速，導(dǎo)致柴胡的市場(chǎng)需求量猛增［2］。柴胡作為山西的優(yōu)質(zhì)道地藥材和傳統(tǒng)大宗藥材，其產(chǎn)量約占全國(guó)產(chǎn)量的1/3 左右，山西從南到北各縣幾乎均有柴胡的生產(chǎn)基地。發(fā)展柴胡種植不僅能夠滿足我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的需求，而且有利于我省的經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型，給藥農(nóng)帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)收益。

香豆素類化合物（coumarin）是一類具有苯駢α-吡喃酮母核的天然化合物，廣泛分布于傘形科、蕓香科等高等植物體內(nèi)［3］?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，柴胡種子富含香豆素類化合物，這些化合物會(huì)抑制柴胡種胚的發(fā)育和種子的發(fā)芽，造成柴胡在規(guī)范化栽培中種子萌發(fā)率低、出苗不整齊［4］。本文研究了不同溶液浸泡對(duì)北柴胡種子中香豆素類化合物的祛除效果，以期為柴胡生產(chǎn)上降低香豆素類化合物的抑制作用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV6100S 紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；熒光微量石英比色皿（宜興市晨偉玻璃儀器廠）；萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；HZC－250 恒溫培養(yǎng)箱（蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

無(wú)水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；香豆素對(duì)照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)S0515AS，純度＞98%）；北柴胡種子購(gòu)自山西省廣靈縣，經(jīng)鑒定為傘形科柴胡Bupleurum chinensis DC.的種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 北柴胡種子的處理

在室溫20 ℃條件下，準(zhǔn)確稱取20 g 北柴胡種子共5 份，分別加入200 mL 蒸餾水、甲醇、乙醇、丙酮和乙醚溶液，浸泡12 h、24 h 后各取出10 g 種子，50 ℃烘干用于供試品溶液制備。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取香豆素對(duì)照品8.02 mg，置100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.080 2 mg/mL 對(duì)照品溶液。

2.3 提取工藝優(yōu)化與供試品溶液的制備

將未經(jīng)處理的北柴胡種子研磨成粗粉，用電子天平稱取1 g，精密稱定，加入無(wú)水乙醇浸泡24 h后回流提取。采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以乙醇用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為因素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，提取條件因素水平表見表1，提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

對(duì)表2 數(shù)值進(jìn)行直觀分析可以看出，各因素對(duì)總香豆素得率影響作用由大到小依次為提取次數(shù)＞乙醇用量＞提取時(shí)間，初步確定最優(yōu)的工藝參數(shù)為A3B1C3，即乙醇用量100 mL、提取3 次、每次1 h。為進(jìn)一步明確各因素水平變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果是否具有顯著影響，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果顯示，提取次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生顯著性影響，乙醇用量和提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響。從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮，確定最優(yōu)提取工藝為A1B1C3，即提取3 次，每次加入無(wú)水乙醇60 mL，每次提取1 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

按優(yōu)化提取工藝進(jìn)行回流提取，合并3 次濾液，無(wú)水乙醇定容至200 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液、樣品溶液分別在波長(zhǎng)200～400 nm 進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果均在322 nm 處有最大吸收，光譜圖形亦基本相同，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為322 nm。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取香豆素對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、5、7 mL，置25 mL 量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，以乙醇為空白，于322 nm 處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析得回歸方程y=0.0267x－0.0057，r=0.9991，結(jié)果表明香豆素對(duì)照品在1.60～22.46 μg/mL 之間與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL 量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6 次，測(cè)得吸光度的平均值為0.171，RSD 為0.753%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，分別于0、0.5、1、1.5、2、4、8、10 h 測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD=1.90%，表明樣品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取未經(jīng)處理的北柴胡種子粗粉6 份，每份1 g，按2.3 方法分別制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算得到北柴胡種子中香豆素的平均含量為0.593%，RSD 為1.87%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取北柴胡種子粗粉約0.5 g，平行操作6 份，置圓底燒瓶中，各精密加入香豆素對(duì)照品溶液（1 mg/mL）3 mL，依據(jù)2.3 方法制備供試品溶液，在322 nm 下測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果表明，平均回收率為98.71%，RSD 為1.30%，該法加樣回收率良好。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn) （n=6）

2.10 不同處理方法種子中香豆素含量的測(cè)定

取不同2.1 中方法處理的北柴胡種子粗粉，按照2.3 方法制備供試品溶液并測(cè)定香豆素的含量，測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 不同處理后北柴胡種子中香豆素的含量 （n=3）

由表5 可知，未經(jīng)處理的柴胡種子中香豆素的含量最高，經(jīng)不同溶劑浸泡后，柴胡種子中香豆素的含量均呈現(xiàn)不同程度的下降，且浸泡時(shí)間越長(zhǎng)柴胡種子中香豆素的含量越低。其中以乙醚溶液浸泡后柴胡種子中香豆素的含量最低，乙醚溶液對(duì)柴胡種子中香豆素的溶出效果最好。

3 討 論

北柴胡種胚的發(fā)育先后要經(jīng)過原胚、棒狀胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和雙子葉胚等幾個(gè)階段［5］。自然成熟期采收的北柴胡種子的胚處于不同發(fā)育階段，經(jīng)石蠟切片研究發(fā)現(xiàn)，約20%左右的種胚處于球形胚，70%左右的種胚處于心形胚，10%左右的種胚發(fā)育到魚雷胚，沒有發(fā)現(xiàn)處于雙子葉胚階段的種胚［6］。自然成熟期的柴胡種胚存在形態(tài)后續(xù)現(xiàn)象，所以即使給予適宜的發(fā)芽條件也不可能萌發(fā)。

傘形科植物中含有香豆素類、皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分［7］，柴胡種子中的香豆素類、皂苷類化合物對(duì)柴胡種胚發(fā)育具有抑制作用，其中香豆素類化合物是種胚發(fā)育的主要抑制物質(zhì)，正是這類化學(xué)成分對(duì)柴胡種胚發(fā)育產(chǎn)生明顯的抑制作用，阻礙柴胡種胚的生長(zhǎng)和分化，導(dǎo)致柴胡種胚的形態(tài)后熟現(xiàn)象［8］。

柴胡種胚存在形態(tài)后續(xù)現(xiàn)象，造成生產(chǎn)上發(fā)芽率低、出苗不整齊，進(jìn)而影響到柴胡的產(chǎn)量和質(zhì)量，這是制約柴胡生產(chǎn)的重要因素。本文在不破壞北柴胡種子結(jié)構(gòu)的前提下，研究了不同溶液對(duì)北柴胡種子中香豆素的溶出效果，以期通過降低種子中香豆素類化學(xué)成分的含量減輕其對(duì)北柴胡種胚發(fā)育的抑制作用，加速北柴胡種胚的發(fā)育成熟，提高種子的發(fā)芽率和出苗整齊度。關(guān)于不同溶液浸泡后對(duì)北柴胡種子的安全性、對(duì)北柴胡種胚發(fā)育和種子發(fā)芽率的促進(jìn)作用有待于進(jìn)一步研究，后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。