血府逐瘀湯對(duì)抑郁模型小鼠行為學(xué)及腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

王永杰，劉廣超，王慧娟，許雪春，張麗娜，李二賢，趙鳳玲

（1.河南省職業(yè)病防治研究院，河南省第三人民醫(yī)院，河南 鄭州450052； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000）

抑郁癥是以情緒低落為主要特征的一類(lèi)心理疾病，主要表現(xiàn)為持久情緒低落、思維遲緩、精力下降、食欲不振、性欲減退、睡眠障礙等［1］。隨著人們生活壓力的增加，抑郁癥的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為威脅人類(lèi)健康的重大問(wèn)題［2-4］。該病屬多因素疾病，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制涉及生理、心理、社會(huì)等多方面，尚未完全明確［5］。臨床上常以藥物、心理、物理等方法綜合治療，雖有一定的緩解作用，但不良反應(yīng)多，依從性差，易復(fù)發(fā)。因此，尋找有效的治療方法顯得尤為重要。

中醫(yī)學(xué)關(guān)于情志病的治療歷史悠久，最早見(jiàn)于《山海經(jīng)》，該書(shū)記載了38 種疾病，其中就有“狂”“癡”等記載。此后，在《呂氏春秋》《楚辭》《左傳》《史記》等文獻(xiàn)中亦有情志致病的記載。情志醫(yī)學(xué)提出于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，其明確病證名稱(chēng)，認(rèn)識(shí)病因病機(jī)，并注意到躁狂、抑郁、雙向障礙，如《靈樞·癲狂》載“狂始生，先自悲也”；還提出了移精祝由法、情志相勝法、語(yǔ)言開(kāi)導(dǎo)法等治法。后世醫(yī)家在《黃帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，對(duì)抑郁癥有更加深入的研究。抑郁癥屬于“郁癥”“百合病”“臟躁”等范疇［6-8］，以情志所傷、氣機(jī)郁滯為主要病因，病機(jī)主要是由于氣機(jī)紊亂、五臟氣血失調(diào)，治療以疏肝理氣、活血化瘀等為主。因此，本研究選用血府逐瘀湯進(jìn)行研究，該方出自王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，方由桃紅四物湯合四逆散加桔梗、牛膝而成，具有疏肝理氣、活血化瘀之功效，契合抑郁癥之病機(jī)。本實(shí)驗(yàn)以昆明種小鼠為對(duì)象，探討血府逐瘀湯對(duì)抑郁小鼠行為學(xué)及腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，為血府逐瘀湯在抑郁癥臨床治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究選用40 只雄性4～6 周齡SPF 昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±4）g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（豫）2015-0004，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于溫度15～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境中，并采用自由采食、飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：HC-2064）；小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀（成都泰盟科技有限公司，型號(hào)：ZZ-6）；電子恒溫水浴鍋（余姚布亞星儀器儀表有限公司，型號(hào)：DZKW-C）；渦旋混勻器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，型號(hào)：XH-D）；酶標(biāo)儀（上海塞默飛世爾儀器有限公司，型號(hào)：MULTISKAN FC）；電子秤（上海精天電子儀器有限公司，型號(hào)：JT601N）；電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BSA224S）。

1.1.3 藥品與試劑 鹽酸氟西汀膠囊（常州四藥制藥公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19980139）；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：fk1983Y）；去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H096）；多巴胺（dopamine，DA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H170）；血府逐瘀湯組方藥材（桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草）均購(gòu)自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并經(jīng)3名中藥師鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 所有40 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組，共4 組。

1.2.2 藥物制備 制備血府逐瘀湯煎劑，藥物由桃仁12 g，紅花9 g，當(dāng)歸9 g，生地黃9 g，川芎4.5 g，赤芍6 g，牛膝9 g，桔梗4.5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草6 g 組成。本研究所有藥物均購(gòu)自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，且經(jīng)3 名中藥師鑒定。所有藥物清洗后，浸泡1 h 后，入鍋，武火燒開(kāi)后，文火煎40 min，去渣，濃縮成每毫升含1 g 生藥的溶液備用。

1.2.3 造模與給藥 40 只小鼠除正常對(duì)照組外，其余30 只小鼠每天選取3～4 個(gè)應(yīng)激因子進(jìn)行慢性不可預(yù)知性刺激（CUMS）。本研究選用的應(yīng)激因子主要是12 h 禁食、12 h 禁水、12 h 45 °傾斜飼養(yǎng)、夾尾（距尾根1 cm 處夾閉1 min）、光照等，持續(xù)3 周，從而建立抑郁癥小鼠模型［9］。中藥給藥劑量根據(jù)人鼠換算公式S小鼠/20g=0.0026×S人/70kg，得血府逐瘀湯給藥劑量（口服劑量）為每只小鼠0.2028 g/20 g（成人120 g/70 kg），即每只小鼠10.14 g/kg。血府逐瘀湯組小鼠按10.14 g/kg（含生藥1 g/mL）劑量灌胃血府逐瘀湯，每日2 次，連續(xù)14 d。鹽酸氟西汀組小鼠按10 mg/kg 劑量（0.1%的鹽酸氟西汀給藥體積為10.14 mL/kg）灌胃鹽酸氟西汀，每日2 次，連續(xù)14 d。按照等量不等濃度的原則，正常對(duì)照組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水，每日2 次，連續(xù)14 d。

1.3 行為學(xué)觀察

1.3.1 自主活動(dòng)次數(shù)測(cè)定 為使實(shí)驗(yàn)小鼠熟悉環(huán)境，先將各組小鼠放入自主活動(dòng)儀10 min，待小鼠適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)是將各組小鼠依次放入自主活動(dòng)儀內(nèi)10 min，在5 min 后，開(kāi)始記錄各組小鼠的水平活動(dòng)次數(shù)、垂直活動(dòng)次數(shù)。

1.3.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 各組小鼠給藥結(jié)束1 h 后，將小鼠尾端2 cm 的部位貼在一根水平木棍上，使小鼠成倒掛狀態(tài)，其頭部離臺(tái)面約5 cm，用板隔開(kāi)相鄰動(dòng)物的視線(xiàn)。比較各組小鼠在6 min 內(nèi)累計(jì)不動(dòng)的時(shí)間。

1.3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 各組小鼠在給藥結(jié)束4 d后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。本研究是將各組小鼠置于水溫25 ℃，水深30 cm 的玻璃燒杯中6 min，觀察6 min 內(nèi)各組小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間的判定標(biāo)準(zhǔn)：小鼠在燒杯內(nèi)漂浮在水面，不努力爬出燒杯，僅做一些必須保持其頭部在水面的動(dòng)作［6］。

1.3.4 大腦海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定 將各組小鼠頸椎脫臼處死，在冰臺(tái)上分離大腦海馬組織，勻漿，3000 r/min 離心20 min，取上清，保存于-20 ℃以下的冰箱。測(cè)定各組小鼠腦組織中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組小鼠水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較 ±s（次， ）

表1 各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較 ±s（次， ）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

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2.2 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較 ±s

表2 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較 ±s

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

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2.3 各組小鼠小鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠5-HT、NE、DA 含量顯著降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組小鼠5-HT、NE、DA 含量升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量比較 ±s（ng/mL， ）

表3 各組小鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量比較 ±s（ng/mL， ）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

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3 討 論

抑郁癥是一種發(fā)病率較高的精神疾?。?］，多由情志改變引起，氣機(jī)阻滯為其核心病機(jī)，主要表現(xiàn)為心情抑郁、情緒不寧、易怒善哭等，而引起抑郁癥的主要因素是應(yīng)激刺激［10］。本研究采用12 h 禁食、12 h 禁水、12 h 45 °傾斜飼養(yǎng)、夾尾等多種低強(qiáng)度刺激的方法制備抑郁癥小鼠模型。該造模方法與人類(lèi)抑郁癥的生物學(xué)機(jī)制接近，如懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是對(duì)抑郁癥患者快感缺乏、興趣缺失、精神運(yùn)動(dòng)遲滯等抑郁癥狀進(jìn)行模擬［11-14］。因此，該方法制備抑郁癥模型，能解釋抑郁癥的顯著異質(zhì)性，可用于本實(shí)驗(yàn)研究。

目前文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯已用于抑郁癥的臨床治療，但實(shí)驗(yàn)室研究較少，其作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明，血府逐瘀湯能明顯增加抑郁小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)，并能明顯減少懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，初步證明該藥有抗抑郁作用。

目前，抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究較多，如單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)、受體假說(shuō)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說(shuō)等，其中腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)得到業(yè)內(nèi)認(rèn)可［15-17］。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，抑郁癥主要是由于單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT、DA 分泌不足所致。因此，抑郁癥治療多以NE、5-HT、DA 為靶點(diǎn)［18-20］，通過(guò)增加腦內(nèi)突觸間隙單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量，增強(qiáng)其生理功能來(lái)起到抗抑郁的作用。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA 法測(cè)定了抑郁小鼠腦內(nèi)海馬組織中NE、5-HT、DA水平，結(jié)果表明，血府逐瘀湯能明顯升高抑郁小鼠腦內(nèi)海馬組織中NE、5-HT、DA 水平，其抗抑郁作用機(jī)制與提高小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察抑郁小鼠自主活動(dòng)次數(shù)、懸尾與強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間等指標(biāo)認(rèn)為血府逐瘀湯具有抗抑郁作用，通過(guò)進(jìn)一步測(cè)定小鼠海馬體內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)（NE、5-HT、DA）水平變化，揭示血府逐瘀湯抗抑郁的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。