槲皮素通過AKT/FOXO3信號通路保護糖尿病大鼠心肌細胞

張煜敏， 張楨燁， 錢玲玲， 王寧， 繆凌峰， 王如興

(南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院心內科， 江蘇 無錫 214023)

糖尿病是人類健康的主要威脅之一，國際糖尿病聯(lián)合會的數(shù)據(jù)顯示，每11個成年人(20～79周歲)中就有1人罹患糖尿病。2019年國際糖尿病聯(lián)盟公布全球糖尿病患者為4.63億，我國高達1.16億，居世界第一[1]。糖尿病心臟病變是糖尿病晚期的主要致死原因之一[2]，其病理表現(xiàn)主要為心肌細胞凋亡、肥厚和心肌間質纖維化并最終導致心力衰竭，其中心肌細胞凋亡是其主要病理改變之一[3]。因此，尋找有效的藥物緩解糖尿病心肌細胞凋亡，有助于改善糖尿病患者的預后，延緩糖尿病患者的心血管并發(fā)癥發(fā)生，降低糖尿病患者的死亡率。

槲皮素是人體日常攝入最多的一種黃酮類化合物，普遍存在于蘋果、茶葉、洋蔥、藍莓等人類日常膳食之中[4]，具有抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、改善糖尿病、舒張血管等多種生物學效應。槲皮素可能是改善糖尿病及其心血管并發(fā)癥的潛在藥物[5]，但其發(fā)揮作用的具體機制尚不完全清楚。

蛋白激酶B(AKT)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠使叉頭核蛋白O3(FOXO3)蛋白在T32位置磷酸化而使FOXO3輸出增加，從而抑制其轉錄功能[6]。在糖尿病情況下，AKT的活性被抑制，從而加重了FOXO3相關的細胞凋亡[7]。槲皮素不僅能夠減少糖尿病時的氧化應激損傷，并且能夠通過磷酸化上調AKT的活性[8]，從而抑制糖尿病時的心肌細胞凋亡。本研究主要探討不同濃度的槲皮素通過激活AKT從而抑制FOXO3對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制，為糖尿病心臟病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；PCR擴增儀、Minispin高速離心機(德國Eppendorf公司)；7500HT 熒光定量 PCR 儀(美國 ABI 公司)；Allegra 46R型高速低溫離心機(美國Beckman Coulter公司)；共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；Nanodrop、BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)。 pAKT，AKT，pFOXO3，F(xiàn)OXO3，BAX，BCL-2，GAPDH抗體均為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；山羊抗兔(中杉金橋公司)；槲皮素、鏈脲佐菌素(STZ)、DMSO、DAPI染液(美國Sigma公司)；TBST(康為世紀公司)；原位細胞死亡檢測試劑盒(美國Roche公司)；Quantinova SYBR Green PCR 試劑盒(德國Qiagen公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；2%異氟醚(瑞沃德公司)。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠來源于常州卡文斯實驗動物有限公司，體重(180±10)g，于清潔級別環(huán)境下飼養(yǎng)，給予12 h交替明暗周期，充足的飼料與水。

1.3 糖尿病大鼠及槲皮素干預模型的建立與分組

參照本課題組以往研究報道的造模方法建立1型糖尿病大鼠模型[9]，將40只SD大鼠隨機分為4組，每組各10只，即對照組、糖尿病組、槲皮素低劑量(50 mg/kg)干預組和槲皮素高劑量(100 mg/kg)干預組。糖尿病模型大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg，1周后尾靜脈采血測血糖，血糖大于16.7 mmol/L判定為糖尿病成模。糖尿病大鼠成模后，每日配置槲皮素溶解于DMSO中，50和100 mg/kg灌胃給藥，1個月后2%異氟醚麻醉測定各項生理數(shù)值后取心肌組織標本。

1.4 大鼠心功能測定

槲皮素灌胃1個月后，每組隨機取大鼠5只，用2%異氟醚麻醉后，應用飛利浦IE33心臟彩超儀在乳頭肌水平測定心功能指標： 左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室內徑(LVID)、左心室收縮末期容積(LVESV)。

1.5 TUNEL染色法檢測大鼠心肌凋亡水平

大鼠心臟先經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，脫水后包埋，切成5 μm的組織切片。將心肌組織切片用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3遍，加入通透液通透10 min，PBS清洗3遍，加入TUNEL反應混合物室溫避光孵育1 h，PBS清洗3遍，滴上DAPI染液，共聚焦顯微鏡觀察大鼠心肌組織細胞凋亡水平。

1.6 實時熒光定量PCR檢測大鼠心肌組織Bax和Bcl-2 mRNA表達

提取心肌組織RNA，測定RNA濃度，經(jīng)逆轉錄為cDNA，用實時定量PCR試劑盒進行擴增，擴增條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。設計引物如下，β-肌動蛋白上游：5′-AGATTACTGCCCTGGCTCCTAG-3′，下游：5′-CCTGCTTGCTGATCCACATCT-3′;Bax上游：5′-GAACCATCATGGGCTGGACA-3′，下游：5′-GTGAGTGAGGCAGTGAGGAC-3′;Bcl-2上游：5′-GAACTGGGGGAGATTGTGG-3′，下游：5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′。

1.7 蛋白質印跡檢測大鼠心肌組織BAX、BCL-2、pAKT、AKT、pFOXO3和FOXO3蛋白表達

提取心肌組織蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，以每孔35 μg總蛋白量上樣，行10%SDS-PAGE，濃縮膠70 V 40 min，分離膠100 V 60 min，100 V 100 min轉膜至PVDF膜上，5%牛奶封閉2 h，TBST緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 值 7.5)清洗3遍，一抗1 ∶1 000孵育過夜。次日，TBST清洗3遍，二抗1 ∶3 000孵育1 h，TBST清洗3遍后，ECL顯色系統(tǒng)發(fā)光顯色，并用Image J軟件(德國 Rawak Software公司)進行灰度值測定。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 建模后大鼠的基本情況

槲皮素灌胃1個月后糖尿病組大鼠體重明顯低于對照組(t=12.14，P<0.05)，槲皮素低劑量干預組與糖尿病組體重差異無統(tǒng)計學意義(t=2.30,P>0.05)，槲皮素高劑量干預組的體重明顯高于糖尿病組(t=4.88，P<0.05)；糖尿病組的心臟重量明顯低于對照組(t=7.805，P<0.05)，其余各組無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 槲皮素對糖尿病大鼠心功能的影響

槲皮素灌胃1個月后，糖尿病組LVEF及FS均明顯低于對照組(t值分別為12.56和11.62，P<0.05), 槲皮素低劑量干預組和高劑量干預組的LVEF均明顯高于糖尿病組(t值分別為4.70和8.36，P<0.05)，槲皮素低劑量干預組和高劑量干預組的FS均明顯高于糖尿病組(t值分別為3.63和6.70，P<0.05)。糖尿病組的LVID明顯高于對照組(t=3.31，P<0.05)。糖尿病組的LVESV明顯高于對照組(t=3.54，P<0.05)，槲皮素高劑量干預組比糖尿病組明顯降低(t=5.77，P<0.05)。見表1。

2.3 槲皮素干預后糖尿病大鼠心肌細胞的凋亡水平

TUNEL染色結果顯示，糖尿病組大鼠心肌組織細胞凋亡率高于對照組(t=11.20，P<0.05)，槲皮素低劑量干預組與槲皮素高劑量干預組凋亡率均明顯低于糖尿病組(t分別為5.88和8.96，P均<0.05)，槲皮素低劑量干預組和高劑量干預組間凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

2.4 槲皮素干預后糖尿病大鼠心肌組織Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白表達

糖尿病組的BaxmRNA及蛋白表達明顯高于對照組(t值分別為 7.71和7.24，P<0.05)，槲皮素干預后較糖尿病組明顯降低(P均<0.05)；糖尿病組的Bcl-2 mRNA及蛋白表達明顯低于對照組(t值為10.65和11.73，P<0.05)，槲皮素干預后較糖尿病組明顯升高(P均<0.05)。見圖2。

A：大鼠心肌組織Bax和Bcl-2 mRNA表達；B、C：各組大鼠心肌組織BAX、BCL-2蛋白表達；*：P<0.05，與對照組相比；#：P<0.05，與糖尿病組相比圖2 槲皮素對糖尿病大鼠心肌組織Bax、Bcl-2mRNA及蛋白表達的影響(n=4)

2.5 槲皮素干預后糖尿病大鼠心肌AKT、FOXO3蛋白及磷酸化水平

糖尿病組的pAKT的表達明顯低于對照組(t=9.19，P<0.05)，槲皮素低劑量干預組與高劑量干預組的 pAKT的表達明顯高于糖尿病組(t值分別為3.25和4.17，P均<0.05); AKT表達在4組之間無明顯差異；糖尿病組的pFOXO3表達明顯低于對照組(t=7.71，P<0.05)，槲皮素低劑量干預組和高劑量干預組的pFOXO3表達明顯高于糖尿病組(t值分別為3.60和3.50，P<0.05)。見圖3。

3 討論

研究表明，多種機制參與了糖尿病時心臟收縮及舒張功能的變化，其中包括心肌能量代謝、心臟結構和功能異常等機制[10]。本研究首先建立STZ誘導的1型糖尿病大鼠模型，期間不僅觀察到糖尿病特征性的多飲多食和體重減輕，而且觀察到明顯的心功能改變包括舒張和收縮功能的下降，提示糖尿病時大鼠心功能受損。糖尿病時的心肌細胞病理改變是糖尿病心臟病變的主要特征，它促成了心衰時心功能的持續(xù)性下降[11]。在心肌梗死、缺血再灌注和糖尿病心肌病等病理狀態(tài)下都可以觀察到心肌細胞凋亡[12-13]。糖尿病時血糖升高，氧化應激增多，心肌細胞也發(fā)生了諸多病理改變[14]。本研究TUNEL染色結果表明糖尿病時期心肌細胞凋亡明顯增多。

多項實驗結果顯示，槲皮素能夠緩解糖尿病及其并發(fā)癥[15-16]。本實驗中槲皮素灌胃給藥后糖尿病大鼠的心功能有所改善，心肌細胞的凋亡減少，但槲皮素對心肌細胞保護作用的劑量依賴性不顯著。進一步分析結果顯示糖尿病時BAX蛋白表達明顯增高，在喂養(yǎng)槲皮素之后BAX蛋白表達水平明顯下降；而另一凋亡抑制蛋白BCL-2在糖尿病時明顯下降，槲皮素干預后表達明顯上升。結果提示槲皮素有對抗糖尿病時心肌細胞凋亡的作用。實時定量PCR結果顯示，Bax與Bcl-2的mRNA表達變化與蛋白一致。這證明了槲皮素能夠在基因水平上改善心肌細胞的凋亡。這一潛在機制可能與AKT/FOXO3信號通路有關，AKT是調控細胞增殖、分化及凋亡中的重要一環(huán)，而FOXO3作為AKT的下游，與細胞的凋亡密切相關[17]。本研究觀察到pAKT蛋白的表達在糖尿病時期有所下降，槲皮素干預后pAKT蛋白的表達明顯上升。而FOXO3在槲皮素干預之后也明顯改善，提示槲皮素對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的保護作用可能與上調AKT/FOXO3通路有關。

綜上，本研究結果表明槲皮素通過激活AKT/FOXO3信號通路減少糖尿病心肌細胞凋亡，從而保護糖尿病心肌細胞，改善心功能。槲皮素可能是治療糖尿病心臟病變的新型潛在藥物。