量子點(diǎn)的制備及其與葡萄球菌蛋白A偶聯(lián)條件的優(yōu)化

王偉， 曹霞， 童珊珊， 余江南， 徐希明

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A, SPA)是一種存在于葡萄球菌細(xì)胞壁的表面蛋白[1]，約占整個細(xì)胞壁蛋白質(zhì)成分6.7%，通過羧基端與細(xì)胞壁肽聚糖呈共價連接。SPA多肽鏈由A、B、C、D、E五個同源區(qū)組成，每個同源區(qū)都能與人及某些哺乳動物血清中IgG的Fc片段結(jié)合，同時又不會對抗體分子Fab片段與抗原結(jié)合位點(diǎn)的活性產(chǎn)生影響[2]。另外，SPA在與IgG的Fc片段結(jié)合的同時還能固定酶、熒光標(biāo)記物等。

熒光免疫層析技術(shù)是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的新型膜檢測技術(shù)[3]。其中，熒光標(biāo)記物包括熒光素[4]、膠體金[5]、量子點(diǎn)[6]等，其中量子點(diǎn)激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄[7]，熒光發(fā)射強(qiáng)度強(qiáng)而穩(wěn)定，耐光漂白，成為熒光免疫層析檢測領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。在熒光免疫層析技術(shù)的應(yīng)用中，每檢測一種抗原或抗體都需要將熒光標(biāo)記物固定于相應(yīng)的抗原或抗體上，探索最優(yōu)結(jié)合條件，這為熒光免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來了不便。因此，作者提出一種設(shè)想，將熒光標(biāo)記物與SPA結(jié)合而形成結(jié)合物，該結(jié)合物可以與人血清中的一些抗體結(jié)合而不影響該抗體與抗原結(jié)合位點(diǎn)的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

CdCl2·2.5H2O、硼氫化鈉、碲粉、丙酮和甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；巰基丙酸和羅丹明B(阿拉丁試劑有限公司)；SPA購自南京福麥斯公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均為美國Sigma公司產(chǎn)品；瓊脂糖(德國Biofroxx公司)；超純水(上海Canrex分析儀器)。

1.2 方法

1.2.1 碲化鎘量子點(diǎn)的制備

1.2.1.1 碲氫化鈉前驅(qū)體溶液的制備 碲氫化鈉采用硼氫化鈉還原法制備，反應(yīng)方程式如下：4NaBH4+2Te+7H2O=2NaHTe+Na2B4O7+14H2↑。

超純水通氮?dú)?0 min除氧備用；稱取0.160 5 g碲粉，0.163 8 g硼氫化鈉于100 mL三頸燒瓶中，加入適量除氧后的超純水，通氮?dú)庥?0 ℃水浴加熱反應(yīng)1 h，反應(yīng)液從黑色逐漸變?yōu)榈仙?，得到新鮮制備的碲氫化鈉溶液。

1.2.1.2 鎘溶液的制備 稱取CdCl2·2.5H2O 0.228 0 g于250 mL三頸燒瓶中，加入適量除氧后的超純水溶解，加入260 μL巰基丙酸，混合均勻，逐滴滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液，快速調(diào)節(jié)溶液pH至9，在此過程中，溶液先由無色變?yōu)榘咨鞚嵋?，再變?yōu)闊o色透明溶液，然后通氮?dú)?0 min。

1.2.1.3 巰基丙酸包被的碲化鎘量子點(diǎn)溶液的制備 按照鎘碲比為1 ∶2的比例吸取適量碲氫化鈉溶液注入鎘溶液中，操作過程全程通氮?dú)?，然后，在油浴加熱攪拌的情況下回流3 h。

1.2.1.4 量子點(diǎn)溶液的純化 取適量量子點(diǎn)溶液于10 mL試管中，按照1 ∶2的比例添加丙酮，渦旋振蕩混合均勻；3 000 r/min離心30 min，棄上清液；加入適量甲醇混勻，3 000 r/min離心20 min；棄上清液，甲醇洗滌3次；37 ℃烘干，加超純水溶解，冷凍干燥備用，量子點(diǎn)溶液避光保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 碲化鎘量子點(diǎn)的表征

1.2.2.1 熒光量子產(chǎn)率的測定 羅丹明B是一種優(yōu)良的熒光染料，穩(wěn)定好，熒光量子產(chǎn)率高，在514 nm激發(fā)波長處量子產(chǎn)率是31%。稱取適量的羅丹明B粉末，配制成濃度為4 μg/mL的羅丹明B水溶液，避光保存；測定羅丹明B在514 nm處的光密度以及在514 nm激發(fā)波長處的熒光光譜，得到熒光峰積分面積。

稀釋制備好的量子點(diǎn)溶液，使得碲化鎘量子點(diǎn)溶液在514 nm處光密度小于0.1，并測定該濃度下碲化鎘量子點(diǎn)在514 nm激發(fā)波長處的熒光光譜，得到熒光峰積分面積，根據(jù)下列公式(1)計(jì)算碲化鎘量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率[8]：

(1)

式中，Yu和Ys分別表示量子點(diǎn)和羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率，Au和As分別表示量子點(diǎn)和羅丹明B在514 nm激發(fā)波長處的光密度，η表示溶液的折射率，F(xiàn)u和Fs分別表示量子點(diǎn)和羅丹明B熒光峰的積分面積。

1.2.2.2 粒徑和電位 取適量碲化鎘量子點(diǎn)溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，使用布魯克海文Zeta電位及激光粒度分析儀測定其粒徑和電位。

1.2.2.3 量子點(diǎn)溶液的紫外光譜和摩爾濃度 取適量碲化鎘量子點(diǎn)溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，使用紫外分光光度計(jì)掃描得到全波長圖，根據(jù)公式(2)、(3)計(jì)算量子點(diǎn)溶液的摩爾濃度[9-10]。

ε=10 043·(D)2.12

(2)

Am=εCL

(3)

式中，D為量子點(diǎn)粒徑，ε為量子點(diǎn)摩爾系數(shù)，C為摩爾濃度，L為1，Am是量子點(diǎn)長波長側(cè)的第一個吸收峰峰值處的光密度。

1.2.3 量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物的制備 吸取適量量子點(diǎn)溶液，10 000 r/min離心5 min，去除量子點(diǎn)團(tuán)聚物。新鮮配制10 mg/mL 的 EDC溶液和NHS溶液；取適量EDC溶液加入碲化鎘量子點(diǎn)溶液中，振蕩混合15 min；再取適量NHS溶液加入碲化鎘量子點(diǎn)溶液中，振蕩混合15 min；立即加入適量SPA溶液，于渦旋混合振蕩器上混合均勻；放于37 ℃恒溫振蕩水浴箱中反應(yīng)2 h；冷卻至室溫，10 000 r/min，離心2 min；去除量子點(diǎn)團(tuán)聚物，4 ℃保存。吸取適量量子點(diǎn)溶液，10 000 r/min，離心5 min，去除量子點(diǎn)團(tuán)聚物。新鮮配制10 mg/mL EDC溶液和NHS溶液；取適量EDC溶液加入碲化鎘量子點(diǎn)溶液中，振蕩混合15 min；再取適量NHS溶液加入碲化鎘量子點(diǎn)溶液中，振蕩混合15 min；立即加入適量SPA溶液，混合均勻，放入37 ℃恒溫振蕩水浴箱中反應(yīng)；冷卻至室溫，10 000 r/min離心2 min；去除量子點(diǎn)團(tuán)聚物，4 ℃保存。制備1%瓊脂糖凝膠，以游離量子點(diǎn)做對照，將樣品依次點(diǎn)樣于凝膠樣品孔中，80 V電泳30 min；分別使用手提式紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)和AI680超靈敏多功能成像儀(美國通用電氣公司)拍攝凝膠成像圖。

1.2.4 量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物制備條件的優(yōu)化

1.2.4.1 碲化鎘量子點(diǎn)和EDC的摩爾比 本部分在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上探究量子點(diǎn)和EDC的摩爾比在1 ∶500，1 ∶1 000，1 ∶1 500，1 ∶2 000時的偶聯(lián)效率，以偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度為指標(biāo)確定合適的量子點(diǎn)和EDC的比例。

1.2.4.2 碲化鎘量子點(diǎn)和NHS的摩爾比 本部分在確定合適的EDC用量的基礎(chǔ)上，探究EDC和NHS的摩爾比在1 ∶0.5，1 ∶1.0，1 ∶2.0，1 ∶2.5，1 ∶3.0，1 ∶4.0時的偶聯(lián)物制備效率，以偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度為指標(biāo)確定合適的EDC和NHS比例。

1.2.4.3 反應(yīng)時間 本部分在已確定EDC、NHS基礎(chǔ)上選擇1，2，3，4 h反應(yīng)時間探究其對偶聯(lián)物制備效率的影響。

1.2.4.4 SPA的用量 為保證偶聯(lián)過程中蛋白完全反應(yīng)，量子點(diǎn)的用量是過量的。本部分在上述篩選出的適宜的EDC、NHS用量和反應(yīng)時間的基礎(chǔ)上探究不同蛋白用量的偶聯(lián)效率。配制10 mg/mL的SPA溶液，分別吸取1.5、2.5、4.0、5.5、7.0 μL蛋白溶液用于偶聯(lián)反應(yīng)，以偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度為指標(biāo)確定合適的SPA用量。

1.2.5 量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物的表征 在最優(yōu)偶聯(lián)條件下制備量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物，測定其紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果

2.1 碲化鎘量子點(diǎn)的表征

2.1.1 熒光量子產(chǎn)率 碲化鎘量子點(diǎn)和羅丹明B在514 nm處光密度和熒光峰面積如表1所示，按照公式(1)計(jì)算可得碲化鎘量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率為24%。

表1 碲化鎘量子點(diǎn)和羅丹明B在514 nm處光密度和熒光峰面積

2.1.2 粒徑和電位 碲化鎘量子點(diǎn)粒徑分布圖如圖1所示，碲化鎘量子點(diǎn)粒徑主要分布在5～15 nm之間，其有效粒徑為9 nm，電位為-20 mV，量子點(diǎn)絕對電位值相對較小，這可能與量子點(diǎn)表面配體鍵合數(shù)量有關(guān)。

圖1 碲化鎘量子點(diǎn)粒徑圖

2.1.3 紫外光譜和摩爾濃度 碲化鎘量子點(diǎn)紫外全波長掃描圖如圖2所示，其長波長側(cè)最大吸收峰位于480 nm處，光密度為4.032，按照公式(2)和(3)計(jì)算可得碲化鎘量子點(diǎn)摩爾濃度為3.8×10-6mol/L。

圖2 碲化鎘量子點(diǎn)紫外全波長掃描圖

2.2 量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物制備條件優(yōu)化

2.2.1 碲化鎘量子點(diǎn)和EDC的摩爾比對量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物制備的影響 由圖3觀察可知，量子點(diǎn)和EDC比例為1 ∶500，1 ∶1 000，1 ∶1 500的三個孔道中存在與游離量子點(diǎn)同一高度的熒光點(diǎn)，這說明偶聯(lián)反應(yīng)中量子點(diǎn)的量是過量的；另外，偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度隨著EDC用量增加呈先增強(qiáng)后降低的趨勢。由灰度值柱狀圖可確定最合適的量子點(diǎn)和EDC用量比例是1 ∶1 500。

左上圖為紫外燈下拍攝；①: 游離量子點(diǎn)；②～⑤: 量子點(diǎn) ∶EDC分別為1 ∶500，1 ∶1 000，1 ∶1 500，1 ∶2 000圖3 不同量子點(diǎn)和EDC比例偶聯(lián)物電泳凝膠成像圖及其灰度值

2.2.2 碲化鎘量子點(diǎn)和NHS的摩爾比對量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物制備的影響 從圖4觀察可知，6個樣品孔中都有與游離量子點(diǎn)同一高度的熒光點(diǎn)，這同樣說明量子點(diǎn)的用量是過量的；另外，EDC ∶NHS為1 ∶0.5，1 ∶1.0，1 ∶2.0，1 ∶2.5，1 ∶3.0時，偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度相近，肉眼無法分辨強(qiáng)弱；而EDC和NHS比例為1 ∶4.0時，偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度明顯較弱。由圖可知，EDC ∶NHS為1 ∶2.0時，偶聯(lián)物灰度值最高，這說明該比例下偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度最高。

左上圖為紫外燈下拍攝；①: 游離量子點(diǎn)；②～⑦: EDC ∶NHS分別為1 ∶0.5，1 ∶1.0，1 ∶2.0，1 ∶2.5，1 ∶3.0，1 ∶4.0圖4 不同EDC和NHS比例偶聯(lián)物電泳凝膠成像圖及其灰度值

2.2.3 反應(yīng)時間對量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物制備的影響 由圖5觀察可知，反應(yīng)時間為2 h時，偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，這與已有文獻(xiàn)報道一致[11]，3 h和4 h偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度降低。

左上圖為紫外燈下拍攝；①: 游離量子點(diǎn)；②～⑤分別為反應(yīng)時間1，2，3，4 h圖5 不同反應(yīng)時間偶聯(lián)物電泳凝膠成像圖及其灰度值

2.2.4 SPA的用量對量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物制備的影響 由圖6觀察可知，隨著SPA用量增加，偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)SPA用量超過4.0 μL時，偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度不再隨著SPA用量增加而增強(qiáng)。由圖可知，SPA用量為5.5 μL和7.0 μL時，偶聯(lián)物灰度值稍弱于4.0 μL。

左上圖為紫外燈下拍攝；①: 游離量子點(diǎn)；②～⑥分別為SPA用量1.5，2.5，4.0，5.5，7.0 μL圖6 不同SPA用量偶聯(lián)物電泳凝膠成像圖及其灰度值

2.3 量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物的表征

碲化鎘量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物紫外吸收圖和熒光光譜如圖7所示。由紫外吸收圖可知，碲化鎘量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物紫外吸收峰發(fā)生紅移；由熒光光譜圖可知，碲化鎘量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物與單純量子點(diǎn)相比，其最大發(fā)射波長發(fā)生紅移。另外，偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度相比單純量子點(diǎn)，其熒光強(qiáng)度略有降低，說明偶聯(lián)過程對量子點(diǎn)的熒光產(chǎn)生了一定影響。

圖7 量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物紫外吸收光譜和熒光光譜

3 討論

量子點(diǎn)的制備方法有多種，本文采用的是“經(jīng)典注入法”，該方法技術(shù)成熟，安全可靠[12]。碲化鎘量子點(diǎn)是眾多量子點(diǎn)中應(yīng)用較為廣泛的一種，巰基丙酸是其常用的羧基修飾物，除此之外，巰基乙酸、谷胱甘肽等也可以用于修飾碲化鎘量子點(diǎn)。碲化鎘量子點(diǎn)制備過程中，回流時間延長，量子點(diǎn)粒徑及熒光顏色都會隨之改變，其粒徑一般在10 nm以內(nèi)，本研究所制備的量子點(diǎn)與其相符合[13]。本研究所制備的量子點(diǎn)電位為-20 mV，其原因可能是量子點(diǎn)顆粒表面鍵合的巰基丙酸相對較少。此外，本研究量子點(diǎn)制備過程中回流時間為3 h，該反應(yīng)時間下量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性較好。

研究發(fā)現(xiàn)，偶聯(lián)反應(yīng)在EDC最適pH 4～6時[14]，量子點(diǎn)溶液穩(wěn)定性較低，易發(fā)生團(tuán)聚及熒光猝滅，實(shí)際使用中pH 7～9都可用于偶聯(lián)反應(yīng)。在偶聯(lián)反應(yīng)中，EDC首先將量子點(diǎn)表面的羧基活化，形成中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物穩(wěn)定性不高，此時，NHS可與活化中間產(chǎn)物結(jié)合，提高活化中間產(chǎn)物的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高偶聯(lián)效率。本研究中，最適量子點(diǎn) ∶EDC ∶NHS為1 ∶1 500 ∶3 000，此時偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度較好；而EDC和NHS過量時，會改變量子點(diǎn)納米顆粒的表面電位，導(dǎo)致量子點(diǎn)發(fā)生團(tuán)聚，熒光猝滅。另外，長時間的偶聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致量子點(diǎn)穩(wěn)定性減小，發(fā)生團(tuán)聚，致使偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度降低；過量SPA會包裹量子點(diǎn)使其熒光無法被激發(fā)，致使熒光強(qiáng)度相對減小。

本研究制備的偶聯(lián)物紫外吸收峰和熒光最大發(fā)射峰均發(fā)生紅移，該情況與已有文獻(xiàn)報道[11]相符。這是因?yàn)镾PA分子具有多個氨基可與多個量子點(diǎn)發(fā)生偶聯(lián)，偶聯(lián)后偶聯(lián)物粒徑增大，發(fā)生量子尺寸效應(yīng)。

在量子點(diǎn)熒光免疫層析技術(shù)的應(yīng)用過程中，最重要的問題是量子點(diǎn)和抗原或抗體偶聯(lián)物的制備。不同的抗體或抗原與量子點(diǎn)偶聯(lián)時，其反應(yīng)條件不同，EDC、NHS、抗原或抗體的用量都會影響偶聯(lián)效果，這也導(dǎo)致使用量子點(diǎn)熒光免疫層析技術(shù)每檢測一種蛋白時，都需要重新探究最佳偶聯(lián)反應(yīng)條件。

由于SPA本身特有的生物活性，量子點(diǎn)-SPA偶聯(lián)物可以代替量子點(diǎn)和待測物相應(yīng)抗體或抗原的偶合物。因而，在使用量子點(diǎn)熒光免疫層析技術(shù)時，只有固定相需要重新制備。

綜上所述，“經(jīng)典注入法”可以制備得到熒光強(qiáng)度較好的羧基化的碲化鎘量子點(diǎn)，其可以與SPA偶聯(lián)，得到熒光強(qiáng)度優(yōu)良的偶合物。