化纖膠囊2號通過調(diào)控氧化應激緩解膿毒癥誘導的大鼠心肌損傷

吳麗麗，梁群

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

膿毒癥是機體感染后炎癥反應失控，出現(xiàn)過強、過激的多器官功損傷[1],經(jīng)充分補液與治療仍舊存在難治循環(huán)障礙的膿毒癥休克，病死率高達30%～40%[2]，而此時循環(huán)障礙多由心臟泵功能衰竭引起[3]。膿毒癥誘導心肌損傷時冠脈血流的充盈并沒有減少，反而隨著膿毒癥的病情加重，冠脈血流有增加，這意味著心肌存在實質(zhì)損傷[4]。膿毒癥過程中細菌產(chǎn)生的毒素，尤其內(nèi)毒素——脂多糖,可以激活前哨巨噬細胞及肥大細胞釋放炎性細胞因子白介素-1前體(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[5]，激活機體免疫反應及吞噬作用[6]。其中嗜中性粒細胞是最主要的殺傷細胞，嗜中性粒細胞由血中游走到感染組織后進一步被激活成為吞噬細菌，在胞內(nèi)形成吞噬溶酶體，通過強大的呼吸暴發(fā)作用殺滅細菌。呼吸暴發(fā)為激活的中性粒細胞增加耗氧量產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基可破壞多糖、氧化蛋白質(zhì)、氧化不飽和脂肪酸，但殺傷細菌的同時還可通過脂質(zhì)過氧化損傷機體的細胞膜及細胞器[7]。膿毒癥通過增強炎癥反應、自由基的產(chǎn)生、氧化應激和細胞凋亡誘導心肌損傷[8]。內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)能加速氧自由基的清除，其活性的降低可進一步加重心肌損傷[9]。本研究從氧化應激的角度探討化纖膠囊2號對膿毒癥后心肌的保護作用，為尋找中醫(yī)藥防治膿毒癥心功能障礙提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠,體質(zhì)量200～230 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心,飼養(yǎng)條件為濕度(60±5)%，溫度(24±3)℃，光、暗循環(huán)12 h。本研究的所有方案均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準。大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.2 實驗分組

取大鼠隨機分為對照組8只;膿毒癥組(CLP組)16只，其中12、24 h每組各8只;膿毒癥+化纖膠囊2號組(CLP+化纖膠囊2號組)16只，其中12、24 h每組各8只。

1.3 實驗造模

使用CLP方法誘導膿毒癥大鼠模型，腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，腹中線切開2～3 cm暴露盲腸，用4-0絲在盲腸中部結(jié)扎，隨后用18號針在結(jié)扎下方穿孔2次，使糞便從穿孔中流出，確保穿刺效果，將盲腸縫合于腹腔內(nèi)位置后閉合腹部。對照組進行手術(shù)，不結(jié)扎、不穿刺盲腸。連續(xù)1周。觀察大鼠的一般狀態(tài)，記錄大鼠體溫、呼吸等生命體征；繪制生存曲線建立膿毒癥心肌損傷模型。

1.4 實驗藥品

化纖膠囊2號方組成如下：黃芪、 紅花、桃仁、制附子制、丹參、當歸、赤芍、熟大黃、茯苓、白術(shù)、黨參、川芎、生地黃、北沙參、麥冬、白芍、蛤蚧粉和炙甘草等。

藥物制備：取上述中藥，參照《中華人民共和國藥典》(2005版)中藥膠囊劑制作方法，由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑室制備化纖膠囊，規(guī)格為0.75 g/粒。具體制備過程為：稱取所有中藥飲片(生藥量105 g)，加入14倍量的蒸餾水，煎煮3次。每次煮沸后再文火煎煮1 h，后用紗布過濾，將得到的3次藥液合并，加壓濃縮為稠膏狀，再制成凍干粉,灌裝膠囊。實驗時用無菌蒸餾水將化纖膠囊2號內(nèi)容物稀釋，至濃度為20 mg/mL。

1.5 給藥方式

對照組：按照對照組造模方法處理后灌腸給予0.9%生理鹽水10 mL/kg。

膿毒癥組(CLP組)：造模后灌腸給予0.9%生理鹽水10 mL/kg。

膿毒癥+化纖膠囊2號組：造模后給予灌腸給藥(0.9%生理鹽水+化纖膠囊2號10 mL/kg)。

1.6 觀測指標

模型制備后于12 h、24 h各時間，取血進行各項檢測。取靜脈血注入試管中立即離心(3 000 r/min)，收集血清存放于-70 ℃冰柜內(nèi)待檢，檢測炎癥肌心肌酶學指標。24 h后處死進行心肌組織勻漿，提取蛋白以備用，觀測氧化應激指標。

1.6.1 炎癥因子的測定

采用ELISA試劑盒，根據(jù)試劑盒生產(chǎn)廠家說明，測定心肌損傷大鼠血清中IL-1β、TNF-α的水平。

1.6.2 心肌酶的測定

每只大鼠取血后，血液3 500 r/min離心30 min。分別用不同的試劑盒測定血清中LDH和CK-MB的水平。

1.6.3 氧化應激標志物的評估

通過ELISA試劑盒測定丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)活性等心肌組織中氧化應激水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α水平比較

與對照組相比，CLP組大鼠血清炎癥因子水平明顯升高(P<0.01)；與CLP組相比，CLP+化纖膠囊2號組中炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平比較

2.2 各組大鼠心肌酶血清中LDH和CK-MB的水平比較

與對照組相比，CLP組LDH和CK-MB水平明顯提高(P<0.01)，而化纖膠囊2號治療逆轉(zhuǎn)了膿毒癥心肌損傷大鼠血清心肌酶的水平(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠心肌酶血清中LDH和CK-MB的水平比較

2.3 各組大鼠氧化應激損傷指標丙二醛(MDA)水平比較

與對照組相比，CLP組心肌組織中MDA水平明顯升高(P<0.01)；而化纖膠囊2號可抑制膿毒癥致心肌損傷大鼠心肌組織中MDA水平升高(P<0.01)。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠氧化應激損傷指標丙二醛(MDA)水平比較

2.4 各組大鼠抗氧化酶胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平比較

與對照組相比，CLP組心肌組織中SOD和GPX活性降低(P<0.01)；而化纖膠囊2號可以增強膿毒癥致心肌損傷大鼠心肌組織中SOD和GPX活性(P<0.01)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠GPx和SOD水平比較

3 討論

膿毒癥患者血清LDH水平可在一定程度反應患者能量代謝狀態(tài)，作為膿毒癥患者休克判定的參考指標和早期病死率的有效預測指標[10-11]。IL-1β、TNF-α可反應機體感染早期炎癥水平[12]。丙二醛(MDA)是細胞膜上多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA增高提示氧化應激增加[13]。谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)屬于機體抗氧化酶，能夠清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。MDA、SOD和GPx結(jié)合多用于評價機體的氧化應激及抗氧化情況[14]。膿毒癥會導致包括心肌組織損傷在內(nèi)的多器官功能障礙，對膿毒癥的治療是一個挑戰(zhàn)。本研究測定膿毒癥心肌損傷大鼠血清炎癥因子、血清心肌酶水平，測定心肌損傷大鼠心肌組織氧化應激損傷及抗氧化水平功能，確定了化纖膠囊2號對膿毒癥心肌損傷的保護作用。在CLP組大鼠中，炎癥的發(fā)生是由于炎癥因子的增加，而化纖膠囊2號的治療改善了炎癥因子水平。炎癥因子、氧化應激激活導致包括心肌組織在內(nèi)的不同器官的損傷。增加抗氧化繼而降低氧化應激反應可以防止心肌組織的損傷，本研究證實，化纖膠囊2號治療可以抑制氧化應激增強水平。

化纖膠囊 2 號以“化纖膠囊”為研發(fā)基礎進行化裁而來?？紤]膿毒癥合并心肌損傷伴有因全身血液高度濃縮引發(fā)的凝血功能異常，以及因血液組分外滲導致的水腫等臨床癥狀，故經(jīng)辨證后在原方的基礎上結(jié)合“桃紅四物湯”“當歸補血湯”“真武湯”等經(jīng)典方劑進行改進。方中黃芪、紅花、桃仁、附子共為君藥，具有益氣活血、扶正固本、溫陽利水的作用[15-17]。

綜上所述，越來越多的證據(jù)表明，膿毒癥誘發(fā)的心肌損傷可增加膿毒癥的病死率。心臟是膿毒癥早期和漸進方式受到深刻影響的器官之一[18]。膿毒癥引起的心肌功能障礙(SIMD)機制并非冠狀動脈血流不足導致的整體性心肌缺血[19]。而是由于膿毒癥期間機體對炎癥的過強、過激反應[20-21]，及中性粒細胞吞噬細菌的呼吸暴發(fā)中產(chǎn)生大量氧自由誘導心肌損傷。研究顯示冠狀動脈血流分布不均、內(nèi)皮損傷、血管內(nèi)纖維蛋白沉積和中性粒細胞浸潤導致心臟微循環(huán)障礙[22]，而氧化應激可引起心肌的不可逆損傷[23]。因此，膿毒癥經(jīng)充分補液與治療后，心臟微循環(huán)恢復，仍舊會存在難治的循環(huán)障礙，目前已證實膿毒癥后存在的心肌實質(zhì)損傷引起心臟功能下降[24]。本研究應用具有益氣活血、扶正固本、溫陽利水作用的中藥化纖膠囊2號治療膿毒癥誘導心肌損傷大鼠，并通過監(jiān)測早期炎癥因子、心肌酶及氧化應激水平的變化，證實了化纖膠囊2號具有減輕膿毒癥的炎癥反應作用，還能降低膿毒癥誘導的心肌損傷大鼠的氧化應激水平，由此達到保護膿毒癥誘導的心肌損傷的目的。