基于網絡藥理學研究紅花治療膜性腎病的分子機制

龐欣欣，石秀杰，彭紫凝，張雅歌，邢玉鳳，韓佳瑞*

(1.河南省中醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，河南 鄭州 450046)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是一種自身免疫性疾病，是僅次于IgA腎病的第二大原發(fā)性腎小球疾病[1]，約占成人原發(fā)性腎病綜合征的1/3[2]。MN主要病理特征為腎小球基底膜免疫復合物沉積及基底膜增厚，臨床起病隱匿，約有50%～75%大量蛋白尿的MN患者在10年內會發(fā)展為終末期腎臟病或者慢性腎臟病[3]。MN患者常常處于高凝狀態(tài)，研究表明，高達1/3的MN患者會出現血栓風險[4]?，F代醫(yī)學對MN患者高凝狀態(tài)的防治主要采用肝素、低分子肝素、華法林等藥物，雖然有一定的療效，但長期使用易導致出血、肝腎功能損害等不良反應。

中醫(yī)藥在MN的治療中取得了許多成果，具有多靶點、個體針對性強、整體調節(jié)等優(yōu)勢[5]，愈來愈受到臨床重視。中醫(yī)學認為MN屬于“水腫”“尿濁”范疇，MN的高凝狀態(tài)屬于“瘀血證”范疇，治療上多采用活血化瘀類中藥防治血栓和栓塞的形成與發(fā)展。紅花是臨床常用的活血化瘀中藥，現代藥理學研究顯示其具有抗凝、改善腎微循環(huán)、降脂、保護免疫功能等作用[6]，常配伍或單獨應用于MN的臨床治療，但其具體機制尚不清楚。本研究通過網絡藥理學的方法挖掘紅花治療膜性腎病的有效成分及作用機制，同時構建紅花有效作用靶點與膜性腎病疾病靶點的蛋白相互作用網絡，探索紅花治療膜性腎病的靶點。并進一步對這些靶點進行疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析、GO和KEGG富集分析，從而為紅花治療膜性腎病的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 紅花有效成分篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺[7](Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)挖掘紅花的所有化學成分，根據各個成分的吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)，即ADME參數篩選有效成分，其中篩選條件為藥物口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug like，DL)≥0.18。

1.2 紅花的作用靶點和MN的相關靶點檢索

采用TCMSP數據庫，以“CarthamiFlos”為關鍵詞，預測篩選紅花有效成分作用靶點。以“Membranous nephropathy”為關鍵詞在GeneCards[8]、DrugBank[9]、DisGeNET[10]、GAD等數據庫中篩選所有與MN有關的所有靶點。

1.3 蛋白互作網絡構建和關鍵靶點篩選

String數據庫可以預測蛋白質之間的相互關系并構建PPI網絡，利用該數據庫構建紅花作用靶點與MN靶點的交集PPI網絡并篩選核心靶點。篩選參數設置主要有：生物機體選擇為人類，最低要求交互分數設置最高置信度0.4。

1.4 紅花治療MN網絡調控可視化

基于紅花和MN的蛋白互作靶點數據，引入紅花可作用于MN的有效成分，采用Cytoscape 3.7.2軟件把這些數據繪制成為可視化網絡圖。其中“圓形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“邊”表示不同成分與靶點之間的關系，挖掘其相互之間的作用關系。即得到紅花治療MN的疾病-藥物-分子-靶點調控網絡圖。

1.5 GO和KEGG富集分析

DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)數據庫廣泛應用于基因注釋，可通過該數據庫挖掘基因與疾病的相關性。通過DAVID工具對紅花和MN交集蛋白靶標基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，得到紅花治療MN潛在靶點可能具有的生物學功能以及主要作用通路。校正統(tǒng)計學超幾何分布定量(P.adjust值)來評估存在于各GO和KEGG注釋中的蛋白生物學功能和通路富集情況的顯著性，P.adjust值在圖中顏色越紅，則顯著性越強。

2 結果

2.1 紅花有效成分ADME分析

檢索TCMSP數據庫中紅花所有成分，按照OB≥30%和DL≥0.18進一步篩選出紅花有效成分22個，見表1。

表1 紅花有效成分ADME分析結果

2.2 紅花的作用靶點和MN的相關靶點檢索結果

通過TCMSP數據庫查找到22個紅花的有效成分中，只有18個有效成分具有相對應的靶點，對這18個有效成分進行靶點基因注釋，刪去不具有基因名稱以及重復靶點，得到187個有效預測藥物靶點。在GeneCards、DrugBank、DisGeNET、GAD等數據庫中篩選MN相關靶點，刪除重復值，共得到3 191個與疾病相關的靶點。取紅花和MN的有效靶點交集，得到128個共同靶基因，見圖1。

圖1 紅花活性成分有效靶基因與MN相關靶基因

2.3 紅花-MN作用靶點蛋白互作關系分析

取紅花活性成分有效靶基因與MN相關靶基因的相互作用的128個靶點，采用String數據庫進行PPI分析，得到2 384條PPI關系，見圖2。取其中富集節(jié)點數目最多的前30個靶點，做出柱狀圖，得到前30個紅花-MN核心靶點,核心靶點圖見圖3，主要有蛋白激酶、白蛋白、炎癥因子、血管內皮生長因子、細胞凋亡相關因子等。

注：黃色：蛋白互作關系;黑色：基因共表達的關系;淺藍色：蛋白同源性;深藍色：基因共進化;紅色：基因融合;綠色：基因臨接。

注：橫軸為富集節(jié)點數目，縱軸為靶點基因名稱。

2.4 紅花治療MN網絡可視化分析

通過Cytoscape軟件進行紅花治療MN的網絡的疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析。納入上述PPI網絡篩選的128個基因和分析篩選得到16個紅花可用有效成分，同時在網絡中加入疾病和藥物使網絡圖更加直觀。網絡可視化圖見圖4。

注：六邊形代表紅花，菱形代表MN，三角形代表紅花16個有效作用成分，圓形代表紅花作用于MN的128個靶點。其中A代表4-[(E)-4-(3,5-dimethoxy-4-oxo-1-cyclohexa-2,5-dienylidene)but-2-enylidene]-2,6-dimethoxycyclohexa-2,5-dien-1-one；B代表7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5,6-g]quinoxaline-2,4-dione；C代表poriferast-5-en-3beta-ol。

2.5 紅花治療MN的機制分析

通過DAVID工具對紅花和MN交集蛋白靶點基因進行GO和KEGG分析，具體得到紅花可治療MN的作用靶點的生物學功能142種，綜合分析后取前20種功能特性，得到紅花有效成分靶點主要通過如DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ型特異性、細胞因子受體結合性、受體配體活性、細胞因子活性等治療MN，見圖5。得到紅花治療MN信號通路有158條，綜合分析后取前20條信號通路。KEGG分析顯示，紅花治療MN的有效靶點主要在晚期糖基化終末產物(advanced glycosylation end products，AGEs)-受體(receptor of AGEs，RAGE)信號通路、人類巨細胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)流體剪切應力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atheroscierosis)、乙型肝炎(Hepatitis B)、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路等，見圖6。其中氣泡或柱形圖顏色越紅，則校正P值越高，顯著性越強，氣泡大小越大或柱形越長，則該生物學功能或該通路富集的靶點越多。根據排名，找到這些靶點最關鍵的AGEs-RAGE信號通路圖，同時用紅色表示紅花靶點在該信號通路上具體作用點，見圖7(所有結果均符合P.adjust<0.05)。

3 討論

近年來,我國膜性腎病的發(fā)病率持續(xù)上升,已由12%增長至50%[11]，具有病程反復、慢性遷延等特點，若得不到及時治療可引起血栓栓塞、心血管事件風險、腎功能衰竭等并發(fā)癥形成，嚴重影響患者生活質量及預后。靜脈血栓栓塞是MN患者常見且嚴重的并發(fā)癥，其導致的年死亡率高達10%[12]。靜脈血栓栓塞臨床多表現為無癥狀，且尚未形成血栓的MN患者是否進行抗凝治療目前仍存在爭議，因此常常影響治療時機。

中醫(yī)藥治療MN療效肯定，在改善腎功能、減輕臨床癥狀的同時，還可以減輕西藥不良反應[13]。根據MN的臨床癥狀，可將其歸屬于“水腫”“尿濁”“虛勞”等范疇。許多中醫(yī)學者認為瘀血是MN的主要病機之一，臨床常配伍應用活血化瘀藥。鄧躍毅教授提出MN患者體內沉積的免疫復合物以及大劑量激素治療可成為損傷機體的“藥毒”，認為膜性腎病患者常為“瘀毒共生”，主張活血、通絡之法應當貫穿MN的治療始終[14]。趙玉庸教授認為“腎絡瘀阻”是MN的基本病機，臨床擅用蟲類藥通腎絡治療MN，收效甚佳[15]。紅花性辛溫，歸心、肝經，具有活血化瘀的功效，是臨床常用的活血化瘀類中藥[16]。紅花在治療MN中常被單獨或者配伍應用，不僅可以改善MN常見的高凝狀態(tài)，而且對蛋白尿也有良好的治療效果[17]。目前紅花治療MN的機制尚不清楚，陳文軍等[18]研究表明,紅花黃色素注射液能夠降低MN大鼠蛋白尿、改善血脂代謝并提高血漿蛋白水平，其機制可能與下調基質金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達有關。

注：“count”值代表與該生物學功能相關的靶點數量;P.adjust表示顯著性。

注：橫軸代表在該信號通路上的靶點數量;P.adjust表示顯著性。

注：紅色表示紅花在信號通路上的作用靶點(原圖來源于KEGG PATHWAY數據庫)。

本研究應用網絡藥理學方法系統(tǒng)地預測了紅花治療MN的潛在分子機制，發(fā)現其具有多通路、多靶點的特點。本研究篩選紅花的有效成分22個，模擬預測187個有效預測藥物靶點和3 191個與疾病相關的靶點相互作用關系，取紅花和MN的有效靶點交集，得到128個共同靶基因，“活性成分-靶點”網絡分析結果顯示，紅花作用于MN的核心靶點主要有蛋白激酶1(AKT1)、白蛋白(ALB)、炎癥因子白介素-6(IL-6)、血管內皮生長因子(VEGF)、Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細胞凋亡相關因子Caspase-3等，通過對以上核心靶點進行功能富集分析，發(fā)現紅花主要通過以下這些生物學功能特性治療MN，如DNA結合轉錄激活活性、細胞因子受體結合性、受體配體活動、細胞因子活性、血紅素結合、四吡咯結合、RNA聚合酶Ⅱ型特異性等。

本研究進一步針對關鍵靶點進行通路富集分析，結果顯示，紅花治療MN主要通過影響AGEs-RAGE信號通路、人類巨細胞病毒感染、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎。其中AGEs-RAGE信號通路為關鍵通路。AGEs-RAGE信號通路激活蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)，一方面PKC可以刺激下游細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)、JNK通路、AKT通路，導致激活蛋白-1(AP-1)、核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路激活，進而引起血管內皮生長因子(VEGF)、細胞黏附分子、炎癥因子等的大量釋放，導致機體損傷[19-20]。另一方面，PKC通路可激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)通路，刺激JNK通路，抑制凋亡抑制因子Bcl-2表達，促進凋亡因子Bax(Bcl-2-associated X protein)蛋白表達而導致細胞凋亡[21]。因此，紅花可作用于AGEs-RAGE下游通路中的多個靶點發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學研究揭示了紅花可能主要通過抗炎、抗細胞凋亡、促進血管生成等發(fā)揮對MN的治療作用。但本研究還存在以下局限性：1)紅花單獨用于MN的臨床或實驗研究較少，主要通過與其他藥物配伍來治療MN，因此未來還可以探索紅花與其他藥物相互作用治療MN的靶點及作用機制；2)目前紅花對MN的研究部分使用注射液，因此本研究采用口服利用度來篩選紅花有效成分具有一定的局限性；3)本文研究結果主要通過數據庫預測紅花作用于MN靶點的預測，今后還需進一步通過體內、體外實驗進行驗證。