大鼠爪印印跡分析用于骨關(guān)節(jié)炎疼痛模型評估

李學(xué)艷，張 春，陳 默，顧成永

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種慢性關(guān)節(jié)退行性病變，關(guān)節(jié)疼痛是其主要臨床癥狀，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[1]。 目前，關(guān)于OA 疼痛的研究越來越多。 然而，人體試驗在人類價值和科學(xué)價值之間存在一定的觀念沖突，所以利用動物模型實現(xiàn)科學(xué)研究成為了必不可少的部分[2]。 但是，在疼痛研究中，客觀準(zhǔn)確的評估動物的疼痛學(xué)行為一直是一個難題。 采用von Frey 絲測定機(jī)械疼痛閾值被認(rèn)為是經(jīng)典的疼痛評估方法，但它極易受到操作者主觀因素干擾，測量值不穩(wěn)定[3]。 近年來CatWalk 步態(tài)分析以其便捷、實時、客觀的優(yōu)勢進(jìn)入疼痛評估的行列[4]，但其價格昂貴，并非多數(shù)實驗室配備。 所以尋找一個較為簡便且經(jīng)濟(jì)、客觀的實驗性疼痛衡量標(biāo)準(zhǔn)極為重要。

分析動物爪印印跡是一個簡易、經(jīng)濟(jì)成本較低且主觀因素較少的測痛方法。 自上世紀(jì)80 年代以來，有學(xué)者提出，測量并分析動物爪印印跡可以有效評估坐骨神經(jīng)及跟腱功能，間接反映功能受損程度[5-6]。 OA 模型是目前研究OA 疼痛的常見模型，不同于功能性受損。 故本研究應(yīng)用OA 模型大鼠爪印印跡，測量并分析足印長度(print length，PL)、足趾擴(kuò)展度(toe spreading length，TS)及中間足趾距離(inter toe distance，IT)，將其與經(jīng)典的 von Frey 機(jī)械痛閾相比較，評估爪印印跡在OA 模型疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立 選取4~6 w 健康雄性SD 大鼠30 只，體重170~220 g。 本研究經(jīng)由南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院實驗動物委員會批準(zhǔn)。 動物房溫度恒定為25 ℃，通風(fēng)良好，且光照與黑暗12 h 周期交替。 給予腹腔注射10 %水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠， 將其固定于手術(shù)臺， 右側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍備皮、消毒、鋪巾，記為實驗側(cè)（Experiment, E）。 根據(jù) Burston等[7]的造模方法，用1 ml 注射器沿脛骨平臺上緣行關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate, MIA)1 mg (50 μl) ，活動大鼠膝關(guān)節(jié)，讓藥物充分?jǐn)U散，左側(cè)不做任何操作，記為正常側(cè)(Normal, N)。 在造模前(第 0 d)、造模后第 7、14、21、28 d 分別測量每只大鼠正常側(cè)和實驗側(cè)后爪機(jī)械疼痛閾值并采集爪印印跡。

1.2 von Frey 測定機(jī)械痛閾 在造模前 (第0 d)、造 模 后 第 7、14、21、28 d 時 測 定 機(jī) 械 縮 足 閾 值(mechanical withdraw threshold,MWT)。 參照 Sagar 等[8]的測量方法，將待測大鼠置于透明箱中，底部放金屬網(wǎng)架。 行為學(xué)測試于每日固定時間進(jìn)行，測試前將大鼠置于透明箱內(nèi)適應(yīng)約1 h，待大鼠安靜，采用不同大小的 von Frey 細(xì) 絲（規(guī)格為 1，1.4，2,4,6,8,10,15,26 g），按照從小到大的順序依次進(jìn)行測試，垂直刺激大鼠足底第二三跖骨之間位置。 刺激持續(xù)時間為8 s， 大鼠出現(xiàn)縮足或舔足現(xiàn)象時記為陽性，同一大小的von Frey 細(xì)絲刺激間隔30 s， 不同大小刺激間隔5 min， 同一細(xì)絲刺激5 次出現(xiàn)3 次陽性時記為最小刺激強(qiáng)度。

1.3 大鼠爪印印跡相關(guān)參數(shù)測量及計算 制作一個長150 cm,寬10 cm 的黑暗狹窄步道，步道底部鋪設(shè)同等大小白紙，終點設(shè)有光孔，以便大鼠直線向終點光亮處行走。將大鼠后爪均勻蘸取墨水（N 為藍(lán)色，E 為紅色）后，置于步道里讓大鼠通過。白紙上印有大鼠后爪印跡，相機(jī)拍攝后用于統(tǒng)計分析。

根據(jù)Murrell 等[6]的測量方法，本研究測量了3個參數(shù)，見圖 1：（1）PL 表示爪印最長距離；（2）TS 表示第一腳趾到第五腳趾的距離；（3）IT 表示第二腳趾到第四腳趾的距離。 選取每張紙上同色的3 個清晰爪印，使用Image J 軟件測量各參數(shù)數(shù)值，計算足印長度因子(print length factor, PLF)、足趾擴(kuò)展因子(toe spreading length factor，TSF) 和中間足趾因子(inter toe distance factor, ITF)，計算公式參照Murrell等[6]的計算公式如下：

PLF=(NPL-EPL)/NPL

TSF=(NTS-ETS)/NTS

ITF=(NIT-EIT)/NIT

圖1 爪印印跡 PL、TS、IT 測量方法

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s 表示。采用重復(fù)測量方差分析比較不同時間點實驗側(cè) MWT、PLF、TSF、ITF 的差異性，LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較；配對t檢驗比較實驗側(cè)與正常側(cè)von Frey 機(jī)械縮足閾值的差異性；采用Pearson相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析， 以相關(guān)系數(shù)r表示兩樣本間的相關(guān)性。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 von Frey 機(jī)械縮足閾值 造模第0 d 時， 大鼠雙側(cè)后爪von Frey 細(xì)絲測量的最大反應(yīng)值均為26 g，雙側(cè) MWT 均為(21.97±5.39)g，兩者無顯著差異。 實驗側(cè)MWT 隨造模天數(shù)逐漸減小，在第28 d 時為最小值(6.07±1.44)g，造模后第 7、14、21、28 d 的 MWT相比第0 d 時差異顯著(P< 0.05)。而正常側(cè)的MWT在造模各時間點比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P> 0.05)。 實驗側(cè)與正常側(cè)間 MWT 在造模后第 7、14、21、28 d比較有顯著差異(P< 0.05)。 見表1 和圖2。

表1 大鼠OA 模型正常側(cè)與實驗側(cè)后爪MWT比較()

表1 大鼠OA 模型正常側(cè)與實驗側(cè)后爪MWT比較()

注: 與正常側(cè)同一時間比較,①P < 0.05;與同組內(nèi)造模前(第0 d)比較,②P < 0.05

造模時間(d) 正常側(cè)(g) 實驗側(cè)(g)0 21.97±5.39 21.97±5.39 7 21.24±5.54 14 23.06±4.96 11.82±2.65 21 21.22±5.53 8.26±1.55 28 22.71±5.12 6.07±1.44

圖2 大鼠OA 模型正常側(cè)與實驗側(cè)后爪MWT 折線圖

2.2 大鼠爪印印跡相關(guān)因子 建立大鼠OA 模型后，隨著造模天數(shù)增加，大鼠通過黑暗步道時爪印的 PLF、TSF、ITF 也隨之增加。 造模后第 7、14、21、28 d 的 PLF、TSF、ITF 相比第 0 d 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。 見表 2。

2.3 相關(guān)性分析 大鼠爪印印跡PLF、TSF、ITF 3個因子與 MWT 呈正相關(guān)（P< 0.05），其中 PLF 相關(guān)性顯著。 見表3。

表2 大鼠OA 模型爪印印跡相關(guān)因子PLF、TSF、ITF 比較()

表2 大鼠OA 模型爪印印跡相關(guān)因子PLF、TSF、ITF 比較()

注:與同組內(nèi)造模前(第0 d)比較,①P ＜ 0.05

造模時間 (d) PLF TSF ITF 0 0.02±0.01 0.03±0.02 0.04±0.02 7 0.12±0.04 0.12±0.04 0.05±0.02 14 0.18±0.02 0.14±0.04 0.07±0.04 21 0.23±0.05 0.16±0.05 0.09±0.03 28 0.31±0.04 0.21±0.06 0.10±0.04

表3 大鼠OA 模型爪印印跡相關(guān)因子PLF、TSF、ITF 與MWT 相關(guān)性分析

3 討論

利用MIA 造模是研究OA 疼痛時較為常見的一種造模方法，MIA 通過破壞軟骨細(xì)胞糖酵解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨丟失以及軟骨下骨重建，疼痛變化顯著[9]。 本研究結(jié)果顯示，隨著造模時間延長，MWT 逐漸降低，大鼠實驗側(cè)后肢的疼痛程度不斷加重，這與其他文獻(xiàn)報道的結(jié)果相一致[8-10]，證實本研究成功建立了MIA誘導(dǎo)的OA 疼痛模型。

爪印印跡相關(guān)因子起初應(yīng)用于坐骨神經(jīng)及跟腱功能的評估，功能受損后，動物后爪行走狀態(tài)以及與接觸地面的著力點都會發(fā)生改變，因此，爪印印跡間接反映了功能受損程度。 但是， 在OA 模型中， 動物是否會因為疼痛導(dǎo)致行走步態(tài)發(fā)生改變，致使爪印印跡的相關(guān)測量數(shù)值變化還尚未研究。 本研究結(jié)果顯示， 爪印印跡相關(guān)因子PLF、TSF 及ITF隨造模時間逐漸增大，3 個因子的數(shù)值代表了實驗側(cè)與正常側(cè)PL、TS、IT 之間的差異， 數(shù)值越大表示差異越明顯。相關(guān)性分析顯示，3 個因子均與反應(yīng)疼痛程度的MWT 呈正相關(guān)，且PLF 相關(guān)性顯著。筆者認(rèn)為，一方面，由于膝關(guān)節(jié)軟骨退變、骨贅形成等導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動受限，關(guān)節(jié)運動功能障礙引起行走步態(tài)改變；另一方面，關(guān)節(jié)病理學(xué)改變后，一系列炎癥因子和致痛因子引起中樞及外周神經(jīng)敏化，促進(jìn)疼痛信號傳遞，痛覺敏化使大鼠后爪蜷縮，行走時接觸地面范圍及受力減少。所以在OA 模型中，大鼠爪印印跡相比正常側(cè)有明顯改變。 因此，爪印相關(guān)因子可以用來反映大鼠OA 模型的疼痛， 并且成為可能替代von Frey 的另一種疼痛評估方法。

近年來，CatWalk 步態(tài)分析儀逐漸被用于評估多種疼痛模型的疼痛學(xué)行為[11-12]。 它使用便捷、測量迅速且相較于von Frey 更為客觀，但價格昂貴這一缺點使多數(shù)研究者望而卻步， 這可能也是von Frey仍然被廣泛使用的原因之一。 爪印印跡分析只需研究者自制避光狹長走道，配備不同顏色染料，成本極低。 爪印印跡也與動物的步態(tài)相關(guān)，由于步態(tài)改變，疼痛一側(cè)的后爪接觸范圍縮小，間接反映了實驗動物的疼痛程度。相較于von Frey，爪印印跡分析避開了人為主觀評估這一因素， 應(yīng)用Image J 標(biāo)尺直接測量，增加了其客觀性。 而在動物本身的影響性這一方面，von Frey 雖然在測量前先讓動物適應(yīng)一段時間，盡量減少這種影響，但是動物自身對疼痛的敏感性這一因素是不可避免的， 包括CatWalk步態(tài)分析儀。

雖然本研究通過相關(guān)性分析證實了爪印相關(guān)因子與經(jīng)典的von Frey 機(jī)械縮足閾值具有相關(guān)性，但是本研究樣本量有限，后續(xù)尚需擴(kuò)大樣本量后進(jìn)行深入探究。 綜上，爪印印跡分析成本低、易操作、結(jié)果客觀，在今后的實驗性疼痛評估中可能具有重要意義。