FDFT1基因重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)測(cè)定

陳曉穎，易雪麗，，陸飛燕，曾怡

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院病原微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

法尼基二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1(farnesyl diphosphate farnesyl transferase 1，F(xiàn)DFT1) ，又稱鯊烯合成酶，是一種分子量為47 kDa的酶，由416個(gè)氨基酸組成。人類FDFT1啟動(dòng)子包含兩個(gè)固醇調(diào)節(jié)元件(sterol regulatory element，SRE)SRE-1基序、一個(gè)倒置的SRE-3 (inverse SRE-3，Inv SRE-3)和一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子Y(nuclear factor，NF-Y)，是SRE結(jié)合蛋白(binding protein，BP)SREBPs的結(jié)合位點(diǎn)。這三個(gè)SREBP結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)與甾醇介導(dǎo)的FDFT1啟動(dòng)子的調(diào)控有關(guān)[1]。SREBPs以轉(zhuǎn)錄因子形式參與膽固醇生物合成途徑的許多基因的轉(zhuǎn)錄。SREBP2是FDFT1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。SREBP2位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，當(dāng)SREBP2被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，與FDFT1啟動(dòng)子中的SRE區(qū)域結(jié)合，激活FDFT1進(jìn)入轉(zhuǎn)錄過(guò)程。FDFT1是膽固醇合成途徑的第一個(gè)酶，通過(guò)兩階段反應(yīng)合成角鯊烯。兩個(gè)焦磷酸法尼酯(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)分子先聚合形成前角鯊烯二磷酸(pre-squalene diphosphate，PSDP)， PSDP再被NADPH還原，生成角鯊烯[2]，角鯊烯通過(guò)氧化、還原等多步驟轉(zhuǎn)化為膽固醇。有研究結(jié)果表明膽固醇代謝異常與癌癥的發(fā)生有關(guān)[3]，因此，與膽固醇代謝相關(guān)的酶和相關(guān)的生物分子被認(rèn)為可能是抗腫瘤治療的靶點(diǎn)[4]，靶向膽固醇代謝治療方法備受重視。FDFT1在膽固醇合成調(diào)節(jié)中起重要作用，因在肺癌、髓系白血病、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)[5]而備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建FDFT1基因重組慢病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步探索FDFT1基因在腫瘤中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2、pCDH-GFP質(zhì)粒載體為南京醫(yī)科大學(xué)盧春教授饋贈(zèng)。PCR引物、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PCR試劑盒、DL 2，000 DNA Marker、 DL 10，000 DNA Marker、DL 15，000 DNA Marker、DNA切膠回收試劑盒、real-time PCR (qPCR)試劑盒為Takara生物公司(大連)產(chǎn)品；內(nèi)切酶XbaⅠ、BamHⅠ購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、EasyGeno重組試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM購(gòu)自Gibco公司； Trizol試劑為卓一生物技術(shù)有限公司(南寧)產(chǎn)品；lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。293T細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 FDFT1基因片段的擴(kuò)增 根據(jù)NCBI登記的FDFT1基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，由Takara生物公司合成，引物序列如下：

FDFT1-上游引物(FDFT1-F)：GGACCGCAGAGGTGAGAGTCGC

FDFT1-下游引物(FDFT1-R)：TTCCTAAAGGTCCCAGCCACAC

以293T細(xì)胞cDNA為模板，普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增，得到FDFT1基因全長(zhǎng)片段。50 μl PCR反應(yīng)體系包括模板1 μl，TaKaRa LA Taq 0.5 μl，2× GC Buffer 25 μl，dNTP Mixture 8 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，ddH2O 14.5 μl。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸150 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；之后72℃加長(zhǎng)延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定擴(kuò)增陽(yáng)性后，-20℃保存。

設(shè)計(jì)FDFT1基因PCR引物，在上下游加入與pCDH-GFP載體同源序列(“”部分)及XbaⅠ、BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)(單下劃線斜體部分)，并在上游引物起始密碼子前增加KOZAK序列(“”部分)增強(qiáng)目的基因表達(dá)，在下游引物終止密碼子前增加V5標(biāo)簽蛋白編碼序列(雙下劃線斜體部分)。引物序列如下：

FDFT1-重組上游引物(FDFT1-重組F)：5′-CCTCCATAGAAGATTCTAGAGCCACCATGGAG

TTCGTGAAATGCCTTGGCCACCCCGAAGAGTT

CTACAACCTGGTGCGCTTC-3′

FDFT1-重組下游引物(FDFT1-重組R)：5′-TCCTTCGCGGCCGCGGATCCTTACGTAGAATCGAG

ACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCATGTTCTCCAGTCTGAACATAG-3′

以前述FDFT1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板再次擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同前述，使FDFT1基因片段上下游分別帶有與載體互補(bǔ)序列及限制性酶切位點(diǎn)。純化擴(kuò)增產(chǎn)物。測(cè)定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pCDH-GFP線性化載體的制備 用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、BamHⅠ酶切pCDH-GFP載體。雙酶切反應(yīng)體系如下：pCDH-GFP質(zhì)粒載體1 μg，XbaⅠ 1 μl，BamHⅠ 1 μl，Cutsmart Buffer 5 μl，ddH2O補(bǔ)足50 μl；雙酶切條件：37℃ 水浴15 min；65℃水浴20 min?；厥彰盖泻蟮膒CDH-GFP載體，并測(cè)定其濃度。純化的pCDH-GFP線性化載體-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 FDFT1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將線性化載體與目的基因通過(guò)同源重組反應(yīng)連接。10 μl反應(yīng)體系如下：線性化載體0.01 pmol，插入片段0.05 pmol，2×EasyGeno Assembly Mix 5 μl，以ddH2O補(bǔ)足10 μl；反應(yīng)條件如下：50℃反應(yīng)15 min，迅速冰上冷卻5 min。將上述反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體系如下：50 μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞；5 μl上述重組產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化條件如下：冰浴30 min；42℃熱激90 s后冰浴150 s；加入350 μl的 LB液體培養(yǎng)基37℃ 180 r/min搖45 min。取100 μl轉(zhuǎn)化液涂布于事先配好的含氨芐青霉素(Amp)的LB固體平板，37℃ 180 r/min倒置培養(yǎng)16～18 h。挑取單菌落接種至分裝好的Amp抗性的LB液體培養(yǎng)瓶并標(biāo)記，37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)60 min。取1 μl菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系及條件同1.2.1。將菌落PCR陽(yáng)性的菌液繼續(xù)培養(yǎng)至16 h后提取質(zhì)粒。將提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，雙酶切體系及條件同1.2.2。對(duì)菌落PCR、雙酶切均符合的質(zhì)粒(命名為pCDH-GFP-FDFT1)進(jìn)行序列測(cè)定(廣州艾基生物有限公司)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將序列比對(duì)正確的質(zhì)粒進(jìn)行批量提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 FDFT1慢病毒的包裝 用胰酶消化293T細(xì)胞，離心棄上清后用10%FBS的完培將細(xì)胞調(diào)整為1×105cells/ml，取2 ml接種至6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染前吸棄上清用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次并盡量吸凈，并用無(wú)血清DMEM潤(rùn)洗1次備用。將提取的pCDH-GFP-FDFT1、pCDH-GFP分別與包裝質(zhì)粒psPAX2 和包膜質(zhì)粒pMD2.G 利用lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h后給細(xì)胞換液，培養(yǎng)至48 h后觀察熒光蛋白GFP表達(dá)情況并收集上清4℃保存。加入新鮮完培繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察熒光蛋白GFP表達(dá)情況并收集上清。將48 h和72 h的上清混合離心后用0.45 μm濾器過(guò)濾，分裝病毒液，-80℃保存。

1.2.5 FDFT1慢病毒的表達(dá)測(cè)定 按照實(shí)驗(yàn)所需將293T細(xì)胞用10%FBS的完培調(diào)整為1×105細(xì)胞/孔，接種至6孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。將實(shí)驗(yàn)所需的病毒液置于冰上并在4℃融化備用。感染前用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次并盡可能吸干凈，隨機(jī)分組并標(biāo)記，對(duì)應(yīng)加入200 μl的FDFT1病毒液(FDFT1-VIR)及陰性對(duì)照病毒液(Ctrl-VIR)，用無(wú)血清的DMEM補(bǔ)足2 ml。感染8 h后以10%的完全培養(yǎng)基給細(xì)胞換液。96 h觀察熒光蛋白GFP表達(dá)，并用Trizol試劑分別提取細(xì)胞RNA，以PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR，運(yùn)用相對(duì)定量法比較兩組樣本FDFT1表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 FDFT1目的基因的擴(kuò)增 以FDFT1-F、FDFT1-R為引物，普通PCR從人全基因組cDNA中擴(kuò)增FDFT1全長(zhǎng)基因并進(jìn)行瓊脂糖核酸電泳，電泳結(jié)果顯示在約1200 bp處出現(xiàn)單一條帶，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期的FDFT1目的條帶1254 bp基本一致，見圖1。以該FDFT1 PCR產(chǎn)物為模板，以FDFT1-重組F、FDFT1-重組R引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使FDFT1兩端加入載體同源序列及限制性酶切位點(diǎn)，經(jīng)瓊脂糖核酸電泳，結(jié)果顯示在約1300 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期的1342 bp基本一致(圖片未顯示)。切膠回收純化帶載體同源序列的FDFT1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到濃度為23.30 ng/μl的FDFT1目的基因DNA。

注：M：DL2，000 DNA Marker；1：FDFT1全基因組片段擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 pCDH-GFP線性化載體制備 用限制性內(nèi)切酶酶切pCDH-GFP質(zhì)粒，酶切后進(jìn)行電泳驗(yàn)證酶切情況。如圖2所示，在約7500 bp處呈現(xiàn)單一條帶(預(yù)期條帶為7544 bp)，說(shuō)明線性化載體制備成功。切膠回收酶切后pCDH-GFP載體，得到濃度為19.04 ng/μl的線性載體DNA。

2.3 FDFT1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 利用同源重組技術(shù)將FDFT1目的基因片段連接到載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化涂布接種含Amp的LB平板，培養(yǎng)16～18 h后挑2個(gè)陽(yáng)性克隆，分別轉(zhuǎn)種至含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)瓶。1 h后取菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定，如圖3所示，只有2號(hào)菌落在約1200 bp處出現(xiàn)條帶。培養(yǎng)至16～18 h，提取菌落PCR陽(yáng)性菌液的質(zhì)粒。質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，如圖4所示，酶切后的質(zhì)粒出現(xiàn)兩條條帶，在約1300 bp及7500 bp處，說(shuō)明目的基因重組成功。將菌落PCR、雙酶切驗(yàn)證均符合的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序(廣州艾基生物有限公司)，測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒含有目的序列，與GenBank中登記的FDFT1(NM_004462)基因同源，表明FDFT1基因重組質(zhì)粒連接成功。

注：M：DL15，000 DNA Marker；1：pCDH-GFP質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。

注：M：DL2，000 DNA Marker；1：1號(hào)菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：2號(hào)菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

注：M：DL15，000 DNA Marker；1：pCDH-GFP-FDFT1質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。

2.4 FDFT1慢病毒包裝 轉(zhuǎn)染48 h后利用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白GFP表達(dá)。如圖5所示，pCDH-GFP組及pCDH-GFP-FDFT1組均可看到綠色熒光，表明構(gòu)建的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

圖5 熒光顯微鏡觀察三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h的293T細(xì)胞(×100)

2.5 FDFT1慢病毒表達(dá)測(cè)定 同體積的Ctrl-VIR及FDFT1-VIR分別感染293T細(xì)胞96 h后，兩組均有綠色熒光表達(dá)，表明包裝的病毒顆粒成功感染293T細(xì)胞。分別提取細(xì)胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qPCR檢測(cè)FDFT1表達(dá)，結(jié)果如表1所示，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，F(xiàn)DFT1-VIR組相對(duì)Ctrl-VIR組上調(diào)15.13倍。

表1 FDFT1慢病毒感染293T細(xì)胞后FDFT1表達(dá)水平

3 討論

膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)膜的重要部分，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的必要脂質(zhì)。膽固醇穩(wěn)態(tài)[6]是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，它在膽固醇的合成、酯化、代謝和運(yùn)輸中起作用。近年來(lái)膽固醇生物合成的變化被認(rèn)為是多種癌癥[7]的標(biāo)志。當(dāng)癌細(xì)胞快速增殖時(shí)，它們依賴于升高的膽固醇生物合成來(lái)提供足夠的膽固醇，以滿足膜生物生成和能量穩(wěn)態(tài)及類固醇激素合成。膽固醇也可以通過(guò)脂質(zhì)筏間接的發(fā)揮促癌作用，通過(guò)富膽固醇的脂筏[8]來(lái)傳導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和生存信號(hào)。也有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇通過(guò)在TME中富集的膽固醇酯和氧甾醇等衍生物來(lái)調(diào)節(jié)其對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響[9]。FDFT1即法尼基二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1是一種膜結(jié)合酶，位于染色體8p.22-23.1區(qū)[10]，參與膽固醇合成分支的調(diào)節(jié)。FDFT1可能作為癌癥的潛在靶點(diǎn)在癌癥的治療中發(fā)揮作用[11]。Hughes SJ等[12]通過(guò)Northern blot分析和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)在8p22-23區(qū)的FDFT1 mRNA過(guò)表達(dá)，在食管腺癌中表達(dá)增加。但Weng ML等[13]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中FDFT1表達(dá)較低，F(xiàn)DFT1作為抑癌基因通過(guò)負(fù)性調(diào)控AKT/mTOR/HIF1α信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制功能。FDFT1既作為一種致癌基因又是一種抑制基因與癌癥密切相關(guān)，目前關(guān)于這種差異產(chǎn)生的原因的研究還很少。這種差異可能不僅是由于FDFT1表達(dá)的變化，而且是由于癌癥中各種膽固醇代謝物如何導(dǎo)致不同反應(yīng)的差異，這也可能是TME對(duì)FDFT1表現(xiàn)出不同反應(yīng)的結(jié)果。關(guān)于FDFT1影響癌癥特征的作用有很多報(bào)道，然而，關(guān)于與FDFT1相互作用的分子的研究卻很少。雖然已經(jīng)有很多關(guān)于FDFT1抑制劑的研究，但大多數(shù)研究都集中在降低血液膽固醇上，似乎還需要更多的研究將其用作抗癌藥物。我們期望能夠通過(guò)構(gòu)建FDFT1慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株以研究FDFT1在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)機(jī)制，為癌癥的治療提供依據(jù)。

傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法存在一定的弊端，不適用于轉(zhuǎn)染效率不高的細(xì)胞，慢病毒載體雖然操作復(fù)雜，但從理論上講病毒顆粒能感染所有細(xì)胞，并能將外源基因整合到宿主染色體上，可以獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，比傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染發(fā)更具優(yōu)勢(shì)[14]。腺病毒載體雖然病毒滴度高，且易于轉(zhuǎn)染其他細(xì)胞，但仍不能克服表達(dá)沉默的自身缺陷[15]。慢病毒載體是以病原體HIV-1 為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，該載體可以將外源基因隨機(jī)插入宿主基因組，具有持久性表達(dá)，感染效率高、安全性高和免疫原性低等優(yōu)勢(shì)[16]。雖然與其他載體相比，慢病毒載體更勝一籌，但其生物安全性方面的局限性是我們所關(guān)注的。近年來(lái)，研究者們也主要著力于改進(jìn)其基因結(jié)構(gòu)，從而增加慢病毒載體的生物安全性[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)包裝產(chǎn)生的病毒為“自殺”性病毒，病毒在感染靶細(xì)胞后不會(huì)產(chǎn)生新的病毒顆粒，也不會(huì)再去感染其他細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建FDFT1慢病毒載體，經(jīng)轉(zhuǎn)染后獲得的病毒液能感染293T細(xì)胞，并表達(dá)FDFT1基因。本文結(jié)果為進(jìn)一步研究FDFT1基因在腫瘤中的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。