敖 慧,劉 方,,朱 健,,陳祖擁
(1. 貴州大學資源與環(huán)境工程學院,貴州 貴陽 550025;2. 貴州喀斯特環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)教育部野外科學觀測研究站,貴州 貴陽 550025)
金屬錳是一種重要的冶金、化工原材料,生產(chǎn)企業(yè)主要分布在貴州松桃、湖南花垣、重慶秀山等“錳三角”地區(qū)。我國錳生產(chǎn)主要以電解工藝為主,碳酸錳礦直接利用硫酸與碳酸錳化合反應制取硫酸錳溶液,經(jīng)加入添加劑如二氧化硒、亞硫酸銨等后進入電解槽進行電解,在電解錳生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的浸出渣、除鐵渣、硫化渣等[1],這些廢渣酸性較強,含有氮、磷、鉀等植物生長需要的營養(yǎng)元素,但也含了大量的錳(Mn)、鉻(Cd)、砷(As)、鉻(Cr)等重金屬元素,露天堆放的電解錳渣在降水的作用下,容易造成堆場周圍土壤及水體的嚴重污染[2-3]。
為了降低電解錳渣中有害元素在環(huán)境中的遷移,利用植物對其吸收、固定是當前土壤修復最常用的方法,針對性地選擇適應能力強的植物類型是電解錳渣堆場生態(tài)修復的重要前提。黑麥草(Lolium perenne)是常見的多年生冷季型草坪草,其生長速度快、生物量大,對重金屬污染的土壤具有較強的適應能力,王加真等[4]的研究結果表明,黑麥草對電解錳渣浸出液具有一定的耐性,當浸出液濃度低于3%時,黑麥草均能正常生長;張永蘭和王友保[5]采用多年生黑麥草對覆土作用下銅尾礦的修復,發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草在銅尾礦基質中能較好生長。此外,紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種產(chǎn)量高、生長周期較短的豆科牧草,對銅(Cu)、鋅(Zn)、鎘(Cd)、鉛(Pb)也具有較好的吸收能力[6],朱劍飛等[7]研究了紫花苜蓿、狼尾草(P. americanum)和黑麥草對Cu和Pb 復合污染土壤的修復能力,表明紫花苜蓿和黑麥草對Pb 均具有較強的富集能力。但是,目前對Mn 脅迫下紫花苜蓿和黑麥草生長變化方面的研究還較少,Mn 是植物生長的必需元素,適量的Mn有利于葉綠素的合成,但是錳過量會抑制植物根系對鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)等元素的吸收,引起活性氧過量導致植物細胞氧化損傷,使葉綠體結構破壞、葉綠素含量下降[8]。因此,本研究通過在土壤中添加不同比例的電解錳渣,探討錳污染土壤上紫花苜蓿和黑麥草生長的響應及其對Mn 的累積特征,為錳渣堆場的生態(tài)修復提供科學依據(jù)。
電解錳渣(electrolytic manganese residue, EMR):采自貴州銅仁松桃縣某電解錳廠;供試土壤,為碳酸巖發(fā)育的石灰性土壤。將采集的樣品在實驗室自然風干過篩后保存?zhèn)溆谩9┰嚥莘N,分別為多年生黑麥草和紫花苜蓿。電解錳渣是電解錳過程產(chǎn)生的酸性廢渣,其pH 為4.89,含有較豐富的營養(yǎng)成分,有效磷含量49.24 mg·kg-1,速效鉀含量269.85 mg·kg-1,堿解氮含量1 876 mg·kg-1,有機質含量70.50 g·kg-1,NH3-N 含量為119.20 mg·kg-1。但也含有大量的有毒有害重金屬,其中,Mn、Cu、Zn、Cr、鎳(Ni)、As、Cd、Pb 含量分別為19 555、75.6、197.3、197.3、58.8、46.8、1.65 和71.7 mg·kg-1。
試驗于2020 年7 月8 日-9 月8 日在貴州大學資源與環(huán)境工程學院大棚內進行,試驗設置5 個處理,每個處理設置3 次重復。即電解錳渣添加量依次為7%、14%、21%、28% 和35%,以不添加錳渣為對照,每個盆栽錳渣-土壤混合基質為1 000 g,用精確度為0.1 g 的天平按照比例稱取供試土壤和錳渣,渣-土混合基質的理化性質如表1 所列,混合均勻后裝入直徑15 cm、高10 cm 的盆內。挑選飽滿、大小均一的草種,清洗過后用吸水紙吸干表面的水分,每盆播種150 粒,7 月8 日到7 月15 日記錄每天的發(fā)芽情況。
表 1 錳渣-土壤混合基質的理化性質Table 1 Physicochemical properties of the mixed soil matrix of electrolytic manganese residue
pH:按照水土比25 ∶ 10,即稱取10 g 基質,加入25 mL 蒸餾水,攪拌10 min,并靜置30 min,浸提液經(jīng)平衡后用pH 計測定。發(fā)芽指標:以幼芽露出土壤表面為準,統(tǒng)計前7 d 種子的發(fā)芽情況。然后計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)。株高與生物量(地上部):盆栽培養(yǎng)周期為2 個月,生長結束后,隨機挑選20 株測量其從地面到植株頂點的拉伸后的株高,取平均值代表植物的株高,用萬分之一的天平稱量每個盆栽的總生物量。光合色素采用95% 乙醇提取,然后分別在波長665、649、470 nm 下測定吸光度,葉綠素a (Ca) = 13.95 A665- 6.88 A649,葉綠素b(Cb) = 24.96 A649- 7.32 A665,類胡蘿卜素含量 = (1 000 A470- 2.05 Ca- 114.8 Cb)/245。丙二醛(malonaldehyde,MDA)采用硫代巴比妥酸顯色法測定;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)采用氮藍四唑法測定;過氧化氫酶(catalase,CAT) 采用高錳酸鉀滴定法測定;過氧化物酶(peroxidase,POD) 采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定[9-10]。土壤和植物Mn 全量:土壤采用HNO3-HF-HClO4高壓消解,植物采用HNO3-HClO4消煮,然后用原子吸收光譜儀進行Mn 含量測定。
用Excel 進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計并計算平均值與標準差,發(fā)芽率 = 第7 天發(fā)芽粒數(shù)/供試種子總數(shù) × 100%;發(fā)芽勢 ∑= 第4 天發(fā)芽粒數(shù)/供試種子數(shù) × 100%;發(fā)芽指數(shù) = (Gt/Dt),Gt為第t 天的發(fā)芽粒數(shù),Dt為相應的發(fā)芽天數(shù)。生物富集系數(shù)(biological concentration factor, BCF)和轉移系數(shù)(translocation factor, TF)通常用來評估植物對重金屬的富集能力,BCF = 植物中重金屬含量/土壤中重金屬含量,TF = 植物地上部分重金屬含量/植物根系重金屬含量。然后采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析,用Origin 進行圖表繪制。
隨著錳渣添加量的增加,紫花苜蓿、黑麥草的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均出現(xiàn)明顯的下降(表2),與對照相比,紫花苜蓿發(fā)芽勢依次下降了7.9%、49.2%、73.2%、91.6%和98.9%,發(fā)芽率依次下降了2.0%、7.1%、39.3%、64.3% 和73.0%,發(fā)芽指數(shù)依次下降了6.5%、28.4%、59.7%、80.3%和86.4%;而黑麥草的發(fā)芽勢依次下降了34.9%、39.5%、70.3%、79.1%和93.0%,發(fā)芽率依次下降了6.9%、17.6%、25.2%、28.2%和45.0%,發(fā)芽指數(shù)依次下降了18.0%、27.5%、43.5%、46.1%和62.5%,這表明電解錳渣對黑麥草、紫花苜蓿種子的萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用,特別是錳渣添加量大于14%時,兩種植物的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均出現(xiàn)顯著性降低(P < 0.05)。
表 2 不同錳渣-土壤混合基質上紫花苜蓿、黑麥草的生長情況Table 2 Growth of Medicago sativa and Lolium perenne in different EMR-soil mixed matrices
紫花苜蓿、黑麥草的株高均隨著錳渣添加出現(xiàn)不同程度的增加(表2),但是總生物量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。土壤添加錳渣后紫花苜蓿的株高明顯的大于對照,當錳渣添加量為21%時,紫花苜蓿的株高達到最大,比對照顯著增加了58.5%;在錳渣添加量為14%時,紫花苜蓿的總生物量達到最大值,比對照顯著提高了198%,在錳渣添加量大于28%時,紫花苜蓿的總生物量顯著低于對照,較對照分別減少了30.1%和63.2%。對黑麥草來說,添加錳渣能明顯促進黑麥草的生長,黑麥草的株高與對照相比依次增加了45.0%、53.9%、88.2%、124.3%和100%,與對照差異顯著(P < 0.05);在錳渣添加量為21%時,黑麥草的總生物量達到最大值,比對照顯著增加了150.5%,在錳渣添加量為35%時,黑麥草的總生物量達到最小,比對照顯著降低了29.2%??梢姡i渣添加后為植物提供了養(yǎng)分,從而促進紫花苜蓿、黑麥草的生長,特別是黑麥草,但是高量的錳渣會顯著降低植物的總生物量。
高等植物中光合色素可分為葉綠素和類胡蘿卜素,隨著錳渣添加量的增加紫花苜蓿的葉綠素和類胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖1),在錳渣添加量為7%和14%的處理中紫花苜蓿的葉綠素含量顯著高于除錳添加量為21%外的其他處理(P < 0.05),當錳渣添加量在14%時紫花苜蓿的葉綠素含量達到最大值,比對照高出59.67%;錳渣添加量增加到28%和35%時,紫花苜蓿的葉綠素含量降低,相比對照依次下降1.50%和5.70%。在錳渣添加量為14%時紫花苜蓿的類胡蘿卜素含量達到最大,比對照高出28.0%;隨著錳渣量繼續(xù)增加,紫花苜蓿的類胡蘿卜素逐漸降低,但各處理與對照的差異未達到顯著性水平。由此可知,低添加量錳渣促進了紫花苜蓿光合色素合成,但是錳渣添加量過高時,則會產(chǎn)生一定的抑制作用。
圖 1 不同錳渣添加量對紫花苜蓿、黑麥草光合色素的影響Figure 1 Effects of different EMR additions on photosynthetic pigments of Medicago sativa and Lolium perenne
黑麥草的葉綠素和類胡蘿卜素含量隨著錳渣添加量的增加均出現(xiàn)不同程度的增加,添加錳渣后,黑麥草的葉綠素和類胡蘿卜素含量均高于對照,在錳渣添加量為14%和21%時,黑麥草的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均顯著高于對照(P < 0.05)。葉綠素含量在14%時達到最大,相比對照高出34.8%;類胡蘿卜素含量在21%時達到最高,相比對照高出48.0%,說明添加錳渣對黑麥草光合色素的合成起到明顯的促進作用。
隨著錳渣添加量的增加,紫花苜蓿的MDA 含量表現(xiàn)出增加的趨勢(圖2)。紫花苜蓿在錳渣添加量為7% 和14% 的處理中,其MDA 含量均顯著低于對照(P < 0.05),依次比對照低27.8%和35.0%;當錳渣添加量增加到21%、28%和35%后,紫花苜蓿的MDA 含量顯著增加(P < 0.05),低添加量錳渣降低了紫花苜蓿的MDA 含量,高含量的錳渣反之,這表明少量的錳渣對紫花苜蓿的生長沒有產(chǎn)生脅迫,而大量的錳渣則會導致植物中活性氧過量,使得MDA 含量顯著增加。但是,土壤添加7%、14%、21%、28%和35% 的錳渣后黑麥草MDA 含量均出現(xiàn)下降,依次比對照降低39.76%、28.72%、47.98%、50.03%和34.03%,尤其是在錳渣量為21% 和28% 時顯著低于對照(P < 0.05),表明錳渣添加后沒有對黑麥草產(chǎn)生氧化脅迫,反而降低了體內的活性氧,緩解植物細胞膜脂過氧化。由此可知,同一處理下紫花苜蓿的MDA 含量高于黑麥草,說明紫花苜蓿受到的氧化脅迫程度比黑麥草高。
添加錳渣后,紫花苜蓿的SOD 活性均高于對照(圖2),在錳渣量為28%時達到最高,顯著高于對照(P < 0.05)。紫花苜蓿的CAT 活性在錳渣添加量為7%時最低;在錳渣量為28%時達到最高,顯著高于對照(P < 0.05)。當錳渣添加量為7%、14%時,紫花苜蓿的POD 活性低于對照,依次較對照降低11.0%和8.0%,但錳渣添加量為35%時紫花苜蓿的POD 活性達到最大值,顯著高于對照(P < 0.05);可見,添加少量的錳渣能夠降低紫花苜蓿的CAT、POD活性,而過量的錳渣會刺激抗氧化酶系統(tǒng),使得CAT、POD 活性增加。對黑麥草來說,隨著錳渣添加量的增加黑麥草的SOD、POD 活性先增加后降低,但是變化幅度均比較小,在錳渣添加量為7%時,黑麥草的SOD 活性最低,較對照顯著降低29.53%,而POD活性在錳渣添加量為28%的處理時達到最低,較對照降低50.25%。錳渣添加后黑麥草的CAT 活性隨著錳渣添加逐漸升高,但均低于對照,添加錳渣后,黑麥草的SOD、POD、CAT活性比對照均出現(xiàn)不同程度降低??梢?,土壤添加錳渣后反而降低了黑麥草的抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性,這說明錳渣添加沒有對黑麥草產(chǎn)生氧化脅迫,但當錳渣添加量大于14%時開始對紫花苜蓿產(chǎn)生脅迫,說明在錳渣-土壤混合基質上黑麥草的耐受性比紫花苜蓿強。
圖 2 不同錳渣添加量對植物MDA 含量、POD、SOD、CAT 活性的影響Figure 2 Effects of different EMR additions on MDA content and POD, SOD, and CAT activities in plants
紫花苜蓿、黑麥草中錳的含量均隨著錳渣添加量的增加而增加(表3)。與對照相比,紫花苜蓿地上部分的錳含量依次增加了42.2%、92.1%、220.1%、1 404.4%和3 810.1%,根系的錳含量依次增加了63.4%、89.1%、384.5%、2 823.5%和8 583.4%,在錳渣添加量為35%時,地上部分錳含量和根系錳含量均達到最大,與對照差異顯著(P < 0.05);黑麥草地上部分的錳含量依次增加了79.2%、111.2%、305.2%、897.1%和1 377.4%,根系的錳含量依次增加了211.5%、347.2%、1 306.8%、8 174.0%和10 606.0%,均在錳渣添加量為35%時最大。總體來說,黑麥草中錳含量大于紫花苜蓿,兩種植物根系的錳含量均大于地上部分,由此可見,紫花苜蓿和黑麥草都主要是通過根系累積錳,且黑麥草的累積量大于紫花苜蓿。
紫花苜蓿和黑麥草的富集系數(shù)隨著錳渣添加量的增加而增加(表3),且根系的富集系數(shù)大于地上部分的富集系數(shù),說明根系的富集能力比地上部分強。在錳渣添加量為35%時,紫花苜蓿和黑麥草地上部分和根系的富集系數(shù)均最大,紫花苜蓿的地上部分和根系的富集系數(shù)分別為0.29 和1.02,分別比對照高314.3% 和827.3%;黑麥草地上部分和根系的富集系數(shù)分別為0.23 和1.75,分別比對照高96.7%和1 358.3%,黑麥草根系的富集系數(shù)明顯大于紫花苜蓿,說明黑麥草根系對錳的累積能力比紫花苜蓿強,而地上部分的富集系數(shù)在錳渣添加量為35%時是紫花苜蓿大于黑麥草,說明在高錳含量的基質中,紫花苜蓿地上部分的錳富集能力大于黑麥草。同一處理中紫花苜蓿的轉移系數(shù)為0.29~0.65,黑麥草的轉移系數(shù)為0.12~0.95,說明紫花苜蓿對錳的轉移能力比黑麥草強。紫花苜蓿和黑麥草的轉移系數(shù)隨著錳渣添加均呈現(xiàn)出減小的趨勢,說明錳渣添加量越高,植物對錳的轉移能力越弱。
由于電解錳渣酸性較強、重金屬全量及有效態(tài)含量高,會對種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用[11],錳渣添加后導致基質的pH 下降,使得紫花苜蓿、黑麥草的發(fā)芽率都出現(xiàn)明顯降低,并且錳脅迫環(huán)境下種子內部儲存物質的分解及轉化受到抑制,進而影響種子萌發(fā)[12]。但是添加少量錳渣可以促進植物生長,通過本研究可以知道,添加錳渣后,黑麥草和紫花苜蓿的株高都高于對照,但是錳渣添加量過高會導致植物總生物量降低,當錳渣添加量大于28%時,紫花苜蓿的總生物量顯著低于對照(P < 0.05),35%的錳渣添加量下,黑麥草的總生物量也顯著低于對照(P <0.05)。說明添加適量的錳渣可以促進植物生長,尤其是黑麥草。這是因為電解錳渣中含有大量的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素,并含有大量可溶性的礦質元素,這為植物生長提供了一定的養(yǎng)分,并且錳元素本身也是植物正常生命活動中所必需微量礦質元素,適量的錳能夠刺激一些酶的活性,促進植物生理代謝及生長[13],但是錳渣添加量過高會起抑制作用。本研究中黑麥草的光合色素含量隨著錳渣添加量的增加均出現(xiàn)不同程度的增加,說明錳渣添加后促進了黑麥草光合色素的合成,而紫花苜蓿的光合色素含量都隨著錳渣添加量的增加先上升后下降,這與朱園芳等[14]的研究結果一致,這是因為高量添加錳渣使得土壤中錳過量,導致葉綠素的合成受到抑制,葉綠素含量下降。錳作為植物生長的必需元素,不僅是葉綠體結構的必要組成成分,還參與了植物光合作用中電子傳遞系統(tǒng)的氧化還原過程及水的光解,對維持葉綠體膜正常的結構有重要的作用[15],但是當達到一定閾值后,高濃度的錳會抑制鎂和鐵等元素的吸收及活性,并導致葉綠體中相關酶活性降低、葉綠體結構被破壞,致使葉綠素合成降低[16-18]。
表 3 不同錳渣添加量紫花苜蓿和黑麥草對Mn 的富集、轉移情況Table 3 Accumulation and transfer of Mn in Medicago sativa and Lolium perenne with different EMR additions
MDA 是植物器官在受到外界環(huán)境脅迫時細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物之一,其含量的高低表示膜脂過氧化程度及植物受損程度[19],重金屬脅迫下,植物體內一系列生化反應會引起活性氧過量,導致植物細胞膜脂過氧化、膜系統(tǒng)受損、生理代謝受阻[18]??寡趸?SOD、CAT、POD)能夠清除細胞內的過量活性氧,保護細胞免受氧化脅迫的傷害。本研究中,錳渣添加量為7% 時,紫花苜蓿MDA 含量和POD 活性均顯著低于對照(P < 0.05),當錳渣添加量大于28%時,MDA 含量、POD 活性均顯著增加(P < 0.05)。錳渣添加后,黑麥草的SOD、POD、CAT 活性相比對照均出現(xiàn)不同程度降低,說明添加錳渣后沒有對黑麥草產(chǎn)生氧化脅迫。徐衛(wèi)紅等[20]的研究中也表明黑麥草對重金屬Zn 有很強的抗性和耐性,即使在高濃度下,黑麥草生長也未受到抑制,還有研究證明黑麥草對Cd、Pb 也有很強的耐性[21]。紫花苜蓿MDA 含量以及抗氧化酶活性均隨著錳渣添加量的增加呈現(xiàn)出不同程度的增加,這與前人研究結果一致[22-23]。添加錳渣后能夠刺激紫花苜蓿的POD 和SOD 活性,有研究表明錳是SOD 的一種輔酶基同時也是許多抗氧化酶的激活劑,因此,高濃度錳使得紫花苜蓿體內的POD 和SOD 活性升高[24-25],并且明顯增加了紫花苜蓿的MDA 含量,這說明高含量錳對紫花苜蓿產(chǎn)生氧化脅迫,進而使得植物生長受到抑制,Smith 等[26]研究也得出,高含量錳會抑制苜蓿的生長,而對黑麥草無影響。由此可知,黑麥草的耐受性大于紫花苜蓿。
此外,本研究中,黑麥草和紫花苜蓿的富集系數(shù)均為根系大于地上部分,這與Inostroza-Blancheteau等[27]的研究結果一致,這可能與植物的耐性機制有關,通過減少向地上部分轉移,從而降低對器官的損傷。黑麥草根系錳含量和富集系數(shù)都大于紫花苜蓿,表明黑麥草的根系富集能力比紫花苜蓿強,這是因為黑麥草具有非常發(fā)達的側根,植物通過根系分泌有機酸活化土壤中的錳,然后形成較為穩(wěn)定的螯合物,不僅促進了植物對錳的吸收[8,26],還降低重金屬的脅迫。并且禾本科草對錳的吸收能力一般超過苜蓿草。黑麥草屬于耐性較強的禾本科草,大部分研究表明,黑麥草對Cd、Cu、Pb、Zn 等重金屬也有較強的累積能力[28-31]。生物富集系可用于評估植物吸收和累積重金屬的能力,其值越大,富集能力越強。紫花苜蓿的轉移系數(shù)大于黑麥草,袁敏等[32]研究也得出,紫花苜蓿對Pb、Zn、Cd 也具有較強的轉移能力,這可能與紫花苜蓿本身水分含量高、蒸騰量大、新陳代謝旺盛等生長特性有關[33],隨著錳渣添加兩種植物的轉移系數(shù)逐漸減小,對照中兩種植物的轉移系數(shù)均為最大,這可能是因為對照的基質中錳含量較低,植物為了維持正常的代謝活動將大部分的錳運輸?shù)角o和葉中。總體來說,黑麥草的耐受性及其對Mn 的富集能力明顯高于紫花苜蓿,更適合作為錳渣堆場生態(tài)修復的先鋒植物。但對于兩種植物對錳的富集和轉運能力有所差異性還有待于進一步研究。
1)電解錳渣的添加會抑制種子萌發(fā),但能促進植物的生長,特別是黑麥草。過高的錳對紫花苜蓿的葉綠素起到抑制作用,但促進了黑麥草的光合色素的合成。添加錳渣后,紫花苜蓿中MDA 含量、抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性出現(xiàn)明顯的提高,而黑麥草中MDA 含量和抗氧化酶活性都低于對照,這兩種植物對高錳環(huán)境都具有一定的耐受性,但黑麥草的耐受性明顯大于紫花苜蓿。
2)總體上,黑麥草對錳的累積能力強于紫花苜蓿,但是紫花苜蓿對錳具有較強的轉運能力,兩種植物都可作為錳渣堆場生態(tài)修復的備選植物,但錳渣對紫花苜蓿的抑制作用大于黑麥草,黑麥草更適合作為錳渣堆場生態(tài)修復的先鋒植物。