飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸組織形態(tài)和空腸微生物區(qū)系的影響

閆小蘭，侯生珍，李鵬翔，王志友，楊葆春，賈建磊

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院, 青海 西寧 810016）

硫是反芻動物體內(nèi)一種常量礦物質(zhì)元素，也是構(gòu)成牛、羊等動物第一限制性氨基酸的元素，在體內(nèi)通常以有機(jī)物的形式存在。硫?qū)λ袆游锒际潜夭豢缮俚?，因?yàn)楹蚧衔?，如氨基酸、激素、B 族維生素和輔酶，是所有生物體正常代謝、結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)功能所必需的。動物對硫的需要是一個適宜量，缺乏和不足均會影響飼料轉(zhuǎn)化率，降低動物的生產(chǎn)性能[1-2]。研究表明，反芻動物的硫需要量通常以氮硫比的形式表示，氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)元素，適宜的氮硫比可促進(jìn)瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)氮的沉積，從而促進(jìn)反芻動物的生長[3-4]。動物營養(yǎng)學(xué)家們早期研究發(fā)現(xiàn)動物品種、生長時期以及硫來源都是影響動物適宜的氮硫比的因素[5-9]。

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所。研究表明，小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力受小腸組織形態(tài)發(fā)育狀況、腸道消化酶以及腸道菌群多樣性等因素的影響[10]。動物腸道寄居著大量微生物，包括細(xì)菌（最多）、古菌、真菌、原蟲和病毒。腸道微生物區(qū)系的形成受個體、年齡、健康狀況和環(huán)境等多種因素的影響。空腸占小腸長度的2/5，空腸微生物數(shù)量相對較少，主要是與空腸中較快的食糜流動速度有關(guān)[11]?？漳c微生物組發(fā)酵結(jié)構(gòu)性碳水化合物生成的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)，具有促進(jìn)腸道黏液分泌、抑制炎癥發(fā)生和為腸上皮提供能量等作用。此外，SCFAs 還能通過抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDACs)活性的方式促使腸上皮細(xì)胞緊密連接，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[12]。

目前國內(nèi)飼養(yǎng)模式主要以現(xiàn)有的作物秸稈類為主要粗飼料，這類飼料能量濃度低，粗蛋白含量少。必需氨基酸嚴(yán)重缺乏。長期飼喂可造成蛋白質(zhì)的缺乏和氨基酸的不平衡，制約養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展。日糧中添加硫或降低氮硫比能增加飼料的轉(zhuǎn)化率，但是各國的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)對反芻動物的適宜氮硫比的規(guī)定存在一定差異。已有的研究結(jié)果也不盡一致，而且多集中在產(chǎn)毛動物上，并且多以無機(jī)硫?yàn)樘砑釉?，尚未進(jìn)行有機(jī)硫?yàn)樘砑釉捶矫娴难芯?。已有研究主要集中于對反芻動物瘤胃發(fā)酵的影響上，而對于其他消化器官的研究較少。因此，本研究以藏羊?yàn)檠芯繉ο?，用利用率較高的蛋氨酸為補(bǔ)充硫源，通過對空腸組織形態(tài)和微生物結(jié)構(gòu)與功能的研究，從而篩選出藏羔羊所適宜的氮硫比例。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)選擇健康狀況良好、體重相近[(12.0 ± 1.0) kg]的60 日齡斷奶藏羔羊150 只(公母比1 ∶ 1)，隨機(jī)分為5 組，每組30 只，用蛋氨酸和賴氨酸替代精料補(bǔ)充料中的麩皮以此調(diào)節(jié)日糧中的氮硫質(zhì)量比為10.5 ∶ 1(A)、9 ∶ 1 (B)、7.5 ∶ 1 (C)、6 ∶ 1 (D)、4.5 ∶ 1 (E)[8-9]。根據(jù)青海省當(dāng)?shù)仫暳显吓渲颇芰亢偷鞍姿较嗨贫蛸|(zhì)量比不同的5 組日糧，日糧組成和營養(yǎng)水平如表1 所列。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

將5 組藏羔羊，分別以氮硫質(zhì)量比不同的日糧進(jìn)行限量飼喂(參考中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，干物質(zhì)采食量為羔羊體重的3%)；采用按組分欄的方式舍飼飼養(yǎng)，分別在每天08:00、16:00 進(jìn)行飼喂，自由飲水。60 日齡開始補(bǔ)飼(羔羊隨機(jī)采食)，預(yù)試驗(yàn)5 d，65 日齡開始正式試驗(yàn)。飼養(yǎng)至180 日齡后，每組隨機(jī)選擇6 只羔羊早上空腹，頸動脈放血屠宰(符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué))，解剖，采集空腸食糜于凍存管中，液氮帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冷凍保存，用于后期空腸食糜細(xì)菌多樣性的測定。另外采集空腸組織(長度2～3 cm)用生理鹽水清洗后，立即放入4%多聚甲醛中固定。

表 1 日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutritional level of experimental diets (dry weight basis)

1.3 試驗(yàn)樣品的測定

1)空腸組織形態(tài)的測定：

空腸組織在固定液中固定3 d 后即可制作冰凍切片，具體制作過程參考于晶[13]方法。制作完成的切片在Olympus BX51 顯微鏡下觀察，Olympus DP21圖像分析系統(tǒng)中的測量工具進(jìn)行測量。每個樣本隨機(jī)選擇3 張非連續(xù)性切片，每張切片選擇3 個非臨近的視野，每個視野中選擇3～5 處測定試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2)微生物多樣性的測定

將采集的空腸食糜樣品送到北京百邁客科技有限公司利用Illumina Hiseq2500 高通量測序平臺進(jìn)行測序。主要流程：提取細(xì)菌中的DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度合格后，使用位于V3+V4 高變區(qū)兩側(cè)的引物338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R: 5'-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)，最后在72 ℃下延長7 min。然后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行庫文質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Hiseq2500 進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析具體參考閆小蘭等[14]方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2013 對數(shù)據(jù)初步整理，應(yīng)用SPSS 25 軟件進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，然后使用Kruskal-Wallis 分析，數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P ＜ 0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮硫比對藏羔羊空腸組織形態(tài)的影響

B 組和E 組的空腸絨毛長度和絨毛寬度顯著高于A、C、D 組(P ＜ 0.05)，且A、D 組的絨毛長度顯著高于C 組(P ＜ 0.05)；D 組的隱窩深度顯著高于其他4 組(P ＜ 0.05)，A、C 組的隱窩深度顯著高于B 組和E 組(P ＜ 0.05)；B、E 組的絨毛長度/隱窩深度顯著高于A、C、D 組(P ＜ 0.05)；B 組和E 組的黏膜層厚度顯著高于C、D 組(P ＜ 0.05)，A 組的黏膜層厚度與其他4 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；B 組的肌肉層厚度顯著高于其他4 組(P ＜ 0.05) (表2)。

表 2 飼糧不同氮硫比對藏羊空腸組織形態(tài)的影響Table 2 Effects of different nitrogen to sulfur ratios on jejunum morphology of Tibetan lambs

2.2 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸食糜微生物多樣性的影響

使用QIIME (version 1.8.0)軟件中的UCLUST對Tags 在97% 的相似度閾值下進(jìn)行聚類，將這些經(jīng)過拼接和優(yōu)化的有效序列數(shù)劃分成1 212 個OTU。每個樣品的OTU 統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3 所列。通過每組樣品OTU 的Venn 圖(圖1)可知：A、B、C、D、E 共5 組之間的共有OTU 數(shù)為95 個，獨(dú)有OTU 數(shù)分別為37、131、34、42和167個，占OTU總數(shù)的比例分別為3.05%、10.81%、2.81%、3.47%和13.78%，表明B 和E 組OTU的組成與其他組相似度較小，差異較大。

空腸細(xì)菌在OTU 水平上基于Bray-Curtis 距離計(jì)算的主坐標(biāo)分析結(jié)果(圖2)顯示，主成分1 和主成分2 的貢獻(xiàn)值分別為17.63% 和12.86%。飼喂同一飼糧的樣品點(diǎn)之間的距離較近，飼喂不同飼糧的樣品點(diǎn)之間的距離較遠(yuǎn)。

表3 列出了5 組藏羔羊空腸食糜樣品的Alpha多樣性指數(shù)。結(jié)果顯示，B、E 兩組的Shannon 指數(shù)顯著高于其他組(P ＜ 0.05)；C、D 兩組的Simpson指數(shù)顯著高于A、B、E 組(P ＜ 0.05)；B、D、E 組的Ace指數(shù)顯著高于A、C 組(P ＜ 0.05)；B、E 組的Chao1 指數(shù)顯著高于A、C 組(P ＜ 0.05)，并且與D 組差異不顯著(P ＞ 0.05)?；蛭膸旄采w率均大于99.9%，因此本研究測序深度能夠滿足后續(xù)分析的要求。

表 3 Alpha 多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indices

圖 1 瘤胃液韋恩圖Figure 1 Venn diagram of rumen fluid

圖 2 主成分分析圖Figure 2 PCoA diagram

2.3 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸微生物菌群結(jié)構(gòu)及功能的影響

2.3.1 飼糧氮硫比對藏羔羊空腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

將所得有效序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)，本研究在門水平上共注釋得到25 種細(xì)菌，其中5 組優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria) (表4)。B 組厚壁菌門的豐度顯著高于C 組(P ＜ 0.05)，但與A、D、E 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；A、C 組的放線菌門豐度顯著高于B、E 兩組(P ＜ 0.05)；B、E 組擬桿菌門的豐度顯著高于A、C 組(P ＜ 0.05)，D 組放線菌門和擬桿菌門的豐度與其他4 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；E 組的變形菌門豐度顯著高于B、D 組(P ＜ 0.05)，A、C 組變形菌門的豐度與B、D、E 組差異不顯著(P ＞ 0.05)。

在屬水平上空腸微生物區(qū)系物種的相對豐度(表5)可看出，厚壁菌門下的克里斯滕森氏菌R7 菌群(Christensenellaceae-R-7-group) 和Quinella 屬、放線菌門下的紅球菌屬(Rhodococcus) 和短桿菌屬(Brevibacterium)以及擬桿菌門下的理研菌科RC9 腸道菌群(Rikenellaceae-RC9-gut-group) 為5 組的優(yōu)勢菌屬。A、C、D 組紅球菌屬的豐度顯著高于B、E 兩組(P ＜ 0.05)；B 組的克里斯滕森氏菌R7 菌群豐度顯著高于其他組(P ＜ 0.05)；A、B 組的Quinella 屬豐度顯著高于D、E 組(P ＜ 0.05)，并且A、B、D、E 組的Quinella 屬豐度與C 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；短桿菌屬和理研菌科RC9 腸道菌群的豐度在各組之間差異不顯著(P ＞ 0.05)。

表 4 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸細(xì)菌門水平豐度的變化的影響Table 4 Effects of different nitrogen to sulfur ratios on the abundance of jejunum bacteria in Tibetan lambs at the phylum level%

表 5 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸細(xì)菌屬水平豐度的變化的影響Table 5 Effects of different nitrogen to sulfur ratios on the abundance of jejunum bacteria in Tibetan lambs at the genus leve l%

2.3.2 功能基因預(yù)測

為比較5 組處理在空腸細(xì)菌功能上的差異，利用16S rRNA 預(yù)測工具PICRUSt 1 軟件對這5 組樣品進(jìn)行功能預(yù)測，在預(yù)測基因功能的同時，參考蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(Clusters of orthologous groups of proteins, COG)對預(yù)測的功能類別進(jìn)行注釋(圖3)?？梢钥闯?，從5 組藏羔羊空腸細(xì)菌注釋到的COG 分別隸屬于25 個功能類別。其中豐度較高的前5 個功能基因?yàn)閮H一般功能預(yù)測、轉(zhuǎn)錄、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、未知功能。其中A、C 組僅一般功能預(yù)測顯著高于B (P ＜ 0.05)，D 組和E 組僅一般功能預(yù)測與其他3 組差異不顯著(P ＞0.05)；D 組轉(zhuǎn)錄顯著高于B、E 組(P ＜ 0.05)；未知功能、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝以及碳水化合物運(yùn)輸和代謝在各組間差異不顯著(P ＞ 0.05) (表6)。

3 討論與結(jié)論

3.1 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸組織形態(tài)的影響

圖 3 原核生物同源蛋白簇?cái)?shù)據(jù)庫功能注釋Figure 3 COG function note

動物機(jī)體的生長發(fā)育不但與營養(yǎng)物質(zhì)的攝入量有關(guān)，而且與其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力密切相關(guān)[15]。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，維持小腸的正常結(jié)構(gòu)與功能對于動物健康至關(guān)重要。評價腸道結(jié)構(gòu)是否完善的指標(biāo)主要有腸道絨毛高度、隱窩深度、腸壁厚度以及黏膜厚度[16]。絨毛長度和高度決定了腸道內(nèi)容物和腸上皮的接觸面積，其值越大對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收速率也就越強(qiáng)。隱窩是絨毛根部上皮下陷至固有層而形成。隱窩的深淺可以反映隱窩細(xì)胞的生成率，隱窩變淺表明腸上皮細(xì)胞成熟率增加，分泌功能增強(qiáng)，消化速率加快[17]。絨毛長度和隱窩深度的比值(villus length/crypt depth, V/C)能夠反映小腸吸收功能和黏膜的損傷情況，比值下降，表明成熟腸上皮細(xì)胞減少，腸黏膜受到損傷，其消化吸收功能降低[18]。小腸腸壁主要由絨毛和隱窩構(gòu)成，腸道消化酶含量和活性對小腸充分消化吸收日糧營養(yǎng)素起著決定性作用[19]。腸道肌層的主要功能是緊張性收縮維持腸道形態(tài)以及參與腸道運(yùn)動。研究發(fā)現(xiàn)，腸道組織形態(tài)的發(fā)育受營養(yǎng)物質(zhì)攝入水平的調(diào)控[20]。對于反芻動物而言，飼糧中未被瘤胃發(fā)酵消化的蛋白質(zhì)、非結(jié)構(gòu)性碳水化合物及微生物蛋白質(zhì)進(jìn)入十二指腸和空腸后由其進(jìn)行進(jìn)一步消化吸收。有研究發(fā)現(xiàn)氮硫比不同會影響瘤胃的發(fā)酵水平，因此造成由瘤胃發(fā)酵后流入空腸的營養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量與質(zhì)量有所不同，進(jìn)而影響空腸的發(fā)育[3-4]。本研究結(jié)果顯示，B 和E 組羔羊的空腸絨毛長度、絨毛寬度、絨毛長度/隱窩深度、黏膜層厚度以及肌層厚度高于其他組，隱窩深度顯著低于其他組，說明氮硫比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1 時小腸的組織形態(tài)發(fā)育較好，更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.2 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸微生物結(jié)構(gòu)及功能的影響

小腸是動物消化道重要的組成部分，腸道菌群具有參與營養(yǎng)與代謝和免疫與保護(hù)、維持腸道菌群平衡、改善腸道環(huán)境、促進(jìn)動物生長發(fā)育等作用[21]。腸道微生物結(jié)構(gòu)受飼糧的調(diào)控。本研究中，B 和E 組的OTU 個數(shù)高于其他組。多樣性指數(shù)間接反映了微生物群落種類以及結(jié)構(gòu)的多樣性，Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)可反映微生物菌群的多樣性，Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)可反映微生物菌群的豐富度。本研究中B 和E 組的Ace 指數(shù)較高，Shannon 指數(shù)顯著高于其他各組，表明飼糧中氮硫比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1 時藏羔羊空腸微生物的豐富度和多樣性較高。本研究中各組覆蓋度均高于99.9%，覆蓋度高于97% 說明測序樣品取樣充分[22]。因此本次測序結(jié)果能真實(shí)地反映藏羔羊空腸微生物群落種類和結(jié)構(gòu)多樣性。

表 6 基因功能豐度Table 6 Gene function abundance%

研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是胃腸道的優(yōu)勢菌門[23-24]。厚壁菌門下的細(xì)菌具有分泌淀粉、半乳糖及丁酸等代謝酶的功能，有助于促進(jìn)機(jī)體對能量的吸收，更利于脂肪的沉積；而擬桿菌門主要參與復(fù)合碳水化合物的發(fā)酵以及其他有機(jī)物的消化[25-26]。另外，有研究表明腸道共生的擬桿菌表達(dá)的一種蛋白能夠快速地招募白細(xì)胞，從而殺死一種導(dǎo)致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，從而阻止IBD 的發(fā)生[27]。本研究中在所有羔羊空腸細(xì)菌中厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門以及變形菌門的相對豐度均較高，是5 組的優(yōu)勢菌門。這與Wang 等[28]研究報(bào)道的綿羊胃腸道中細(xì)菌主要以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為主的結(jié)果基本一致。厚壁菌門是胃腸道內(nèi)重要的纖維消化菌，能夠消化纖維生成乙酸。擬桿菌門為重要的淀粉消化菌，能夠促進(jìn)丙酸的沉積[29]。本研究中B 組和E 組的厚壁菌門和擬桿菌門數(shù)量較高，說明B 組和E 組更有利于空腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化。放線菌門諾卡菌科中含有許多機(jī)會致病菌，能引起動物多處炎癥反應(yīng)[30]。本研究中，羔羊空腸放線菌門的豐度呈現(xiàn)C ＞A ＞ D ＞ E ＞ B 的變化趨勢，并且C 組的放線菌門豐度顯著高于B 和E 組，說明氮硫比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1時能有效降低條件病原菌的豐度。另外，B 組互養(yǎng)菌門的相對豐度高于其他組?；ヰB(yǎng)菌門具有降解氨基酸和丙酮酸的能力，屬于革蘭氏陰性厭氧桿菌。在屬水平上，5 組的優(yōu)勢菌群均為紅球菌屬、短桿菌屬、克里斯滕森氏菌科R7 菌群、理研菌科RC9 腸道菌群以及Quinella 屬。紅球菌屬和短桿菌屬均屬于放線菌門諾卡菌科下的菌屬。紅球菌屬是一類可利用許多有機(jī)化合物作為唯一碳源的菌屬，但是不具備降解酪蛋白、纖維糖、幾丁質(zhì)、彈性蛋白或木聚糖的能力，并且動物感染后會出現(xiàn)發(fā)燒、乏力等癥狀[31]。短桿菌屬是膽固醇氧化酶的高產(chǎn)菌[32]。在B 和E 組紅球菌屬的豐度顯著低于其他水平，B 組的克里斯滕森氏菌科R7 菌群豐度顯著高于其他各組，理研菌科RC9 腸道菌群在各水平之間差異不顯著，但在B 水平下豐度較高，A 和B 水平下Quinella 屬的相對豐度顯著高于D 和E 組。克里斯滕森氏菌科R7菌群和Quinella 屬是厚壁菌門下的菌屬，與纖維的消化分解有關(guān)，而理研菌科具有降解結(jié)構(gòu)性碳水化合物的作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)，理研菌科RC9 腸道菌群能夠促進(jìn)肌肉中n-3 多不飽和脂肪酸 (n-3 Polyunsaturated fatty acids, n-3PUFA)的沉積。因此，B 和E 組羔羊空腸食糜微生物的結(jié)構(gòu)均有利于動物的生長發(fā)育。

腸道菌群可促進(jìn)羔羊營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，提高免疫力。本研究中PICRUSt 預(yù)測結(jié)果顯示，試驗(yàn)羊空腸菌群主要的功能與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝等新陳代謝類功能有關(guān)，表明腸道菌群積極參與了藏羔羊的日常代謝活動。轉(zhuǎn)錄和能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換與化合物的代謝緊密聯(lián)系。因此本研究結(jié)果也顯示出微生物中含有較高豐度的與轉(zhuǎn)錄、能量轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因。5 組樣品的微生物群落所具有的基因功能一致，但是相對豐度不同，其原因可能為不同菌群所具有的基因功能具有相似性。

綜上所述，可以得出以下結(jié)論：1) 飼糧氮硫質(zhì)量比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1 時羔羊空腸組織形態(tài)發(fā)育較好，微生物的相對豐度和多樣性較高；2) 羔羊空腸微生物菌群功能主要集中于氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝和碳水化合物的運(yùn)輸與代謝；3)蛋氨酸價格較高且有毒性，不適用于羔羊的長期飼喂，因此日糧氮硫質(zhì)量比為9 ∶ 1 更有利于藏羊的規(guī)?；B(yǎng)殖。