膽堿對奶牛肝臟脂肪代謝的調(diào)控作用及機(jī)制

劉喆佳，王弘浩，姚軍虎，曹陽春

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 陜西 楊凌 712100）

隨著科學(xué)技術(shù)在畜牧業(yè)領(lǐng)域的不斷創(chuàng)新和發(fā)展應(yīng)用，集約化、現(xiàn)代化、規(guī)?；B(yǎng)殖已十分普遍，畜禽生產(chǎn)周期大幅度縮短，生產(chǎn)效率快速提高，而動物疾病的發(fā)生制約著畜牧業(yè)生產(chǎn)的進(jìn)一步發(fā)展，因此，動物常見疾病的防控與治療對于進(jìn)一步提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益十分重要，仍是畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中急需解決的問題[1]。在奶牛生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，處于圍產(chǎn)期的奶牛易發(fā)生酮病和脂肪肝等肝臟脂肪代謝疾病[2]，導(dǎo)致肝臟功能受損，極大地降低了奶產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)效益，嚴(yán)重制約我國奶業(yè)的高速發(fā)展[3]。

膽堿作為動物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)素，在動物體內(nèi)可構(gòu)成多種生理活性物質(zhì)，參與機(jī)體代謝。一般情況下，奶牛體內(nèi)可以自身合成一定量的膽堿滿足基礎(chǔ)需要，但對于高產(chǎn)奶牛尤其是在泌乳高峰期，需要更多的膽堿維持其生產(chǎn)性能，因此，奶牛生產(chǎn)往往需要額外補(bǔ)充適量膽堿[4]。由于膽堿在瘤胃的易降解性，市場上主要以過瘤胃膽堿(rumen-protected choline，RPC)的形式添加到奶牛飼料中[5]，飼糧中補(bǔ)充膽堿能夠有效降低奶牛肝臟脂肪沉積，達(dá)到治療和預(yù)防脂肪肝的效果，從而提高生產(chǎn)性能[6]。大量研究已證明膽堿在調(diào)節(jié)奶牛肝臟脂肪代謝方面具有重要作用，對其作用機(jī)制的探索也受到越來越多的關(guān)注，主要集中在AMPKα (adenosine monophosphateactivated protein kinase α)信號通路的激活和膽堿的一碳單位循環(huán)兩種途徑。本研究闡述了膽堿的基本性質(zhì)及生理功能，圍繞膽堿在奶牛肝臟脂肪代謝中的調(diào)控作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 膽堿的基本性質(zhì)和生理功能

膽堿(三甲基乙醇胺)，分子式為(CH3)3N(CH2)2OH，是一種吸濕性較強(qiáng)的季胺堿，質(zhì)地是無色粘稠，并略帶魚腥味的白色易潮解的針狀晶體。膽堿在動植體內(nèi)多以種不同的形式存在，主要有乙酰膽堿、磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘磷脂等形式。在飼料中也包含多種形式的膽堿，主要以磷脂酰膽堿的形式存在[7]，以衍生物和游離態(tài)形式存在的膽堿比較少[8]。正常情況下，動物體內(nèi)可自身合成膽堿，在一些特殊的生理狀態(tài)下，如奶牛圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡狀態(tài)，需要在飼料中額外補(bǔ)充適量膽堿，以保證奶牛生理功能正常。為保證穩(wěn)定性，動物生產(chǎn)上通常以氯化膽堿的形式作為添加劑添加到日糧中[9]。

膽堿是動物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)素，在動物體內(nèi)以多種形式存在并發(fā)揮不同的作用，其在代謝中的主要生理功能包括[10-12]：1) 維持生物膜組成結(jié)構(gòu)完整。膽堿能夠在機(jī)體內(nèi)合成卵磷脂和神經(jīng)鞘磷脂，參與構(gòu)成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和脂蛋白，維持細(xì)胞正常生理功能和結(jié)構(gòu)完整性；2) 促進(jìn)體內(nèi)甲基代謝。膽堿作為甲基供體，可提供不穩(wěn)態(tài)甲基，與胍基乙酸生成肌酸，還可生成肉堿、腎上腺素等活性物質(zhì)，參與機(jī)體甲基代謝。膽堿在機(jī)體內(nèi)，能夠氧化轉(zhuǎn)化為甜菜堿，甜菜堿作為甲基供體可通過甲基化反應(yīng)生成蛋氨酸，蛋氨酸可以繼續(xù)將甲基傳遞給S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM-e)，在機(jī)體內(nèi)參與一碳單位的代謝循環(huán)。膽堿、甜菜堿和蛋氨酸作為主要的甲基供體，三者多數(shù)情況下能夠在體內(nèi)進(jìn)行補(bǔ)充或替代；3) 保證信號分子的傳遞。膽堿參與乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的合成，作為神經(jīng)遞質(zhì)維持基本的神經(jīng)信號傳遞過程；4) 促進(jìn)腦部正常生長發(fā)育和提高記憶力；5) 促進(jìn)脂肪代謝。膽堿能夠通過促進(jìn)載脂蛋白的合成，加快肝臟脂肪向外周轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低脂肪在肝臟的沉積；6) 調(diào)控細(xì)胞凋亡[11]。

2 膽堿對奶牛肝臟脂肪代謝的調(diào)控作用

圍產(chǎn)期奶牛受特殊生理階段的生理應(yīng)激影響，干物質(zhì)采食量明顯下降，而圍產(chǎn)前期胎兒的快速發(fā)育和圍產(chǎn)后期奶牛的泌乳均需要大量的能量。為滿足圍產(chǎn)期的能量需求，奶牛主要通過動員體脂來進(jìn)行自身代謝的調(diào)控，采食量的嚴(yán)重不足和過量的體脂動員極易使奶牛處于能量負(fù)平衡(negative energy balance，NEB)狀態(tài)[13]。奶牛體脂動員會分解產(chǎn)生的大量非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids，NEFA)通過血液進(jìn)入到肝臟進(jìn)行代謝，主要有以下3 條途徑：1) 完全氧化進(jìn)行供能，生成二氧化碳和水；2) 當(dāng)生成的NEFA 的量超出肝臟的氧化能力時(shí)，一部分NEFA 會不完全氧化生成酮體，包括β-羥丁酸(βhydroxybutyric acid，BHBA)、丙酮和乙酰乙酸，酮體積累過多易引發(fā)酮病；3) 再酯化生成甘油三酯(triglycerides, TG)，與載脂蛋白結(jié)合以極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)形式轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，由于肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)TG 能力有限，導(dǎo)致過量的TG 積累在肝臟，易形成脂肪肝。酮病和脂肪肝等肝臟代謝性疾病會造成肝臟功能受損，加劇奶牛NEB，直接影響奶牛的生產(chǎn)性能，降低奶牛的生產(chǎn)效率和奶產(chǎn)品品質(zhì)，增加了飼養(yǎng)成本，減少了企業(yè)生產(chǎn)效益[14]。

許多研究表明，飼糧中補(bǔ)充RPC 對奶牛有益，能夠增加奶牛圍產(chǎn)期采食量[15]，降低肝臟脂肪沉積[16]，調(diào)控能量代謝[17]，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力[18]，提高生產(chǎn)性能[19]。Cooke 等[20]在誘導(dǎo)奶牛脂肪肝過程中每天補(bǔ)充15 g RPC，處理組血液中NEFA 濃度降低，肝臟中TG 含量降低；馬晨等[21]發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期奶牛基礎(chǔ)日糧中添加25 g·d-1膽堿效果最好，顯著提高了奶牛產(chǎn)奶量，降低了血液中NEFA 和BHBA 的含量，提高奶牛繁殖性能；其他研究人員[22-23]也證實(shí)補(bǔ)充RPC 一定程度上可以提高產(chǎn)奶量，降低肝臟脂肪沉積。最新研究發(fā)現(xiàn)，飼喂RPC 的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間對泌乳奶牛的生產(chǎn)性能會產(chǎn)生不同的影響，當(dāng)RPC 補(bǔ)充發(fā)生在圍產(chǎn)期時(shí)，提供12.9 g·d-1的膽堿有利于奶牛的生產(chǎn)性能，但在產(chǎn)后22 d 后補(bǔ)充RPC 沒有觀察到額外的益處[24]。以上研究均表明膽堿對奶牛肝臟脂肪代謝有調(diào)控作用，能夠緩解能量負(fù)平衡狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療脂肪肝的效果，但對于膽堿的最適添加量和最佳飼喂時(shí)間還需要進(jìn)一步研究。

膽堿主要通過上調(diào)脂肪分解和下調(diào)脂肪生成途徑的基因和蛋白的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)脂肪代謝，降低奶牛肝臟脂肪沉積，分別從脂肪代謝的3 個(gè)方面進(jìn)行，包括減少脂肪合成，促進(jìn)脂肪氧化，促進(jìn)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.1 對脂肪合成的調(diào)控

膽堿可能通過調(diào)節(jié)脂肪分解基因減少脂肪合成。過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是與脂肪生成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，已知脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase，LPL)基因是其下游基因[25]，LPL能夠水解乳糜微粒和極低密度脂蛋白中甘油三酯的生成脂肪酸和甘油的關(guān)鍵限速酶，促進(jìn)細(xì)胞從極低密度脂蛋白中攝取脂肪，Goselink 等[26]在奶?；铙w采樣試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于沒有觀察到LPL 基因表達(dá)的變化，補(bǔ)充RPC 誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)沉積減少不能歸因于在脂肪組織中改變脂肪分解。硬脂酰輔酶A 去飽和酶(stearyl coenzyme A dehydrogenase，SCD)是催化飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的重要限速酶，在脂肪合成和分解及能量代謝中起重要的調(diào)控作用，在王艷輝[27]的試驗(yàn)中證明了添加膽堿組相對于對照組硬脂酸含量下調(diào)，說明膽堿以通過調(diào)控SCD 基因表達(dá)，減少脂肪沉積。膽堿還可下調(diào)脂肪合成，減少脂肪沉積。乙酰輔酶A 羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCα)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)參與脂肪酸的合成過程，是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[28]。孫菲菲[29]在研究中發(fā)現(xiàn)，添加膽堿可以明顯抑制ACC和FAS 的基因表達(dá)量，減少肝細(xì)胞脂肪蓄積。

2.2 對脂肪氧化的調(diào)控

脂肪酸氧化主要是在線粒體中進(jìn)行β-氧化，游離脂肪酸進(jìn)入線粒體基質(zhì)的過程是脂肪酸進(jìn)行β-氧化的限速環(huán)節(jié)，而肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase，CPT1A)是脂肪酸進(jìn)行β-氧化的關(guān)鍵限速酶，能夠催化細(xì)胞內(nèi)脂肪酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為脂肪酰肉堿進(jìn)入線粒體[30-31]。肉堿是重要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在脂肪酸氧化過程中起關(guān)鍵作用，能夠幫助長鏈脂肪酸進(jìn)入到細(xì)胞線粒體內(nèi)。Coleman 等[32]在奶牛能量負(fù)平衡狀態(tài)期間，給奶牛補(bǔ)充膽堿發(fā)現(xiàn)肝臟TG 含量降低，CPT1A 顯著增加，表明線粒體β-氧化能力增加。在日糧中添加膽堿，可通過增加肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC22A5 的表達(dá)[26]，促進(jìn)肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)輸送，增加動物肝臟中肉堿水平[33]，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體進(jìn)行氧化分解[34]。

2.3 對脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控

肝臟中的脂肪主要以VLDL 的形式向外周轉(zhuǎn)運(yùn)[35]，磷脂酰膽堿是合成VLDL 的重要成分[36]，對脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)過程起重要作用。膽堿通過兩種途徑生成磷脂酰膽堿：肝臟中70% 的膽堿通過CDP 這一途徑合成，30% 通過PEMT 體內(nèi)生成途徑合成，當(dāng)膽堿外源攝入不足時(shí)，PEMT 途徑供應(yīng)肝臟內(nèi)的磷脂酰膽堿發(fā)揮主要作用，但同時(shí)需要SAM-e 的參與[37]。而VLDL 的合成、組裝與分泌還需要載脂蛋白B(apolipoprotein B100，Apo B)[38]和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTTP)[39]的協(xié)助完成。ApoB 是合成VLDL 所必需的蛋白質(zhì)，MTTP 能夠幫助脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，使新生的ApoB 與其結(jié)合，并通過形成原始脂蛋白顆粒運(yùn)輸?shù)桨?。有研究發(fā)現(xiàn)，增加膽堿的添加量可以通過調(diào)節(jié)PPARα 通路上調(diào)MTTP 和ApoB-100 的表達(dá)水平，進(jìn)而增加VLDL 的合成、組裝與分泌，促進(jìn)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)，減少肝臟脂肪沉積[40]。載脂蛋白A5 (apolipoprotein A5，ApoA5)與VLDL 和高密度脂蛋白相關(guān)，并且參與降低肝臟脂肪含量的過程[41]。已有研究表明，隨著膽堿供應(yīng)增加，ApoA5 也隨之線性增加，說明膽堿可能通過提高ApoA5 的表達(dá)來減少肝臟脂肪沉積[32]。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(fatty acid transport protein，F(xiàn)ATP)是參與調(diào)控脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪代謝的關(guān)鍵因子，能夠協(xié)助長鏈脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)脂肪沉積。Goselink 等[26]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充膽堿可提高FATP5 的表達(dá)量，緩解奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡，證明了添加膽堿能夠促進(jìn)脂肪從肝臟向外周轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)脂肪代謝。

3 膽堿對奶牛肝臟脂肪代謝的調(diào)控機(jī)制

膽堿具有很好地調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂代謝的作用，能夠顯著降低肝臟脂肪沉積，達(dá)到緩解奶牛能量負(fù)平衡的效果。目前，對膽堿調(diào)節(jié)奶牛肝細(xì)胞脂代謝機(jī)制的研究有限，主要通過激活A(yù)MPK 信號通路和膽堿的一碳單位循環(huán)兩個(gè)途徑(圖1)。

3.1 AMPKα 介導(dǎo)的膽堿調(diào)控脂肪代謝

AMPK 是重要的細(xì)胞能量代謝調(diào)控元件，激活A(yù)MPK 通路可通過磷酸化或去磷酸化調(diào)節(jié)下游分解和合成代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)因子或蛋白的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞能量代謝的調(diào)控[42]，PPARα、LXRα 和SREBP-1c 的表達(dá)均受到AMPKα 的調(diào)控[43]。有研究發(fā) 現(xiàn)，1.5 mmol·L-1的NEFA 誘 導(dǎo) 的LO2 肝 細(xì) 胞 損傷模型可抑制細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝，增加細(xì)胞內(nèi)TG 的沉積，降低CPT-1α、ACC、FAS 的mRNA 表達(dá)量，并且能夠抑制AMPKα 的表達(dá)[44]，當(dāng)在此模型中添加膽堿后，促進(jìn)了AMPKα 磷酸化，該作用能被BML-275 (一種AMPKα 抑制劑) 阻斷，并能夠增加PPARα、CPT-1α 和ApoB-100 的基因表達(dá)水平，降低LXRα 和SREBP-1c 的表達(dá)，同時(shí)抑制ACCα 和FAS的表達(dá)，而BML 只阻斷了LXRα 的表達(dá)，說明膽堿可以通過激活A(yù)MPKα 磷酸化調(diào)節(jié)PPARα 和LXRα的轉(zhuǎn)錄活性，并獨(dú)立于AMPKα 調(diào)節(jié)SREBP-1c，以促進(jìn)NEFA 處理的肝細(xì)胞中脂質(zhì)氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)對肝臟細(xì)胞脂代謝調(diào)控作用[45](圖2)。以上研究證明AMPKα 可通過調(diào)節(jié)其下游PPARα、LXRα和SREBP-1c的表達(dá)水平介導(dǎo)膽堿調(diào)控肝臟細(xì)胞脂肪代謝。

圖 1 膽堿對奶牛肝臟脂肪代謝的調(diào)控途徑Figure 1 The regulation of choline on fat metabolism in dairy cow livers

圖 2 膽堿和蛋氨酸對肝臟代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制Figure 2 The regulatory mechanism of hepatic metabolism by choline and methionine

還有其他研究發(fā)現(xiàn)，膽堿對肝臟脂代謝的調(diào)節(jié)不能通過影響PPARα 激活來實(shí)現(xiàn)，而是通過提高PPARδ 的表達(dá)來降低脂肪在肝臟的沉積[26]。膽堿調(diào)控下游調(diào)控因子可能還存在其他途徑，LXRα-SREBP-1c通路可以不依賴 AMPKα 來調(diào)控肝細(xì)胞脂肪代謝和緩解脂肪肝[46-47]。膽堿通過PPAR、LXRα和SREBP-1c調(diào)控肝臟細(xì)胞脂代謝是否僅依賴AMPK 信號通路以及是否還有其他調(diào)節(jié)途徑還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

3.2 膽堿的一碳單位循環(huán)

膽堿在體內(nèi)可以被氧化，轉(zhuǎn)化生成甜菜堿，甜菜堿作為甲基供體在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，通過甲基化反應(yīng)給同型半胱氨酸提供一個(gè)甲基生成蛋氨酸[48-49]。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸還能在肝臟內(nèi)各種酶的參與下合成肉堿，刺激 CPT-1A 的表達(dá)[50-51]，進(jìn)而能夠促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入到線粒體進(jìn)行β-氧化，減少脂肪沉積。蛋氨酸還能轉(zhuǎn)化為SAM-e[52]，SAM-e 給磷脂酰乙醇胺提供游離甲基參與體內(nèi)磷脂酰膽堿的合成[53]，構(gòu)成VLDL，幫助脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，降低肝臟脂肪沉積(圖3)。還有研究表明，膽堿通過一碳單位循環(huán)生成一些非酶抗氧化物質(zhì)，如谷胱甘肽[54-55]，提高細(xì)胞抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激和炎性損傷的發(fā)生，維持肝細(xì)胞代謝功能正常進(jìn)而緩解能量負(fù)平衡，間接促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝，此結(jié)論還需要更多試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.3 其他途徑

研究表明，補(bǔ)充了過瘤胃膽堿的母牛在產(chǎn)犢后，表現(xiàn)出肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體2 (GLUT2)的mRNA表達(dá)量顯著提高[26]，并且丙酮酸羧化酶 (PC)的mRNA 表達(dá)水平降低，說明膽堿的補(bǔ)充很可能促進(jìn)了肝臟的糖異生能力[56]，促進(jìn)碳水化合物在奶牛體內(nèi)的代謝利用，減少脂肪過度動員，進(jìn)而促進(jìn)能量平衡，緩解奶牛的能量負(fù)平衡狀態(tài)，維持了肝細(xì)胞正常的脂代謝功能。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，膽堿提高了高濃度NEFA 模型下肝細(xì)胞氧化應(yīng)激關(guān)鍵因子Nrf2[57]的表達(dá)量，并且降低了炎癥因子TNF-α 的表達(dá)[29]，說明膽堿可能增強(qiáng)了肝細(xì)胞的氧化能力，緩解了能量負(fù)平衡狀態(tài)下的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)了肝細(xì)胞脂代謝作用。

圖 3 轉(zhuǎn)甲基化循環(huán)中膽堿和蛋氨酸代謝途徑與控制甲基轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶之間的交叉Figure 3 Intersection between pathways of choline and methionine metabolism in the transmethylation cycle and key enzymes that control methyl group transfer

4 小結(jié)

奶牛在能量負(fù)平衡狀態(tài)時(shí)，是脂肪肝等營養(yǎng)代謝性疾病的高發(fā)期，膽堿作為一種營養(yǎng)素，對調(diào)節(jié)奶牛肝臟脂肪代謝具有重要作用，補(bǔ)充膽堿可有效改善奶牛脂肪肝。膽堿主要是通過上調(diào)脂肪分解和下調(diào)脂肪生成途徑基因和蛋白的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)脂肪代謝，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制已有研究，主要集中在AMPK 信號通路的激活和膽堿的一碳單位循環(huán)途徑(圖3)，各調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)次序和模式還有待進(jìn)一步研究確認(rèn)，明晰膽堿調(diào)控奶牛肝臟脂代謝的核心關(guān)鍵通路及機(jī)制，從而確定合適的膽堿添加量及添加方式，對奶牛有效營養(yǎng)調(diào)控和提高生產(chǎn)效益具有重要價(jià)值。