復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病藥物敏感性與耐藥基因表達(dá)的相關(guān)性分析*

李賽男，祁文瑾，黃 蓉，何 霞

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科,昆明 650032)

復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)是在1年內(nèi)VVC癥狀發(fā)作4次或以上的外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)[1]，是常見(jiàn)的婦產(chǎn)科感染性疾病，約占微生物所致陰道炎的25.0%～30.0%。RVVC治療困難，癥狀易反復(fù)，且由于抗生素的不合理使用增多，導(dǎo)致RVVC菌株產(chǎn)生耐藥性可能。近年來(lái)，RVVC的發(fā)病率逐年升高，且主要致病菌種仍為白假絲酵母菌，而非白假絲酵母菌的致病性亦增高[2-3]。在白假絲酵母菌外排泵系統(tǒng)中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)是其耐藥機(jī)制產(chǎn)生的重要原因，其中研究較多的外排泵基因是MDR1、CDR1和CDR2。CDR1是白假絲酵母菌最早發(fā)現(xiàn)的外排泵基因，CDR1基因過(guò)表達(dá)被認(rèn)為與其耐藥有著密切關(guān)系[4]。本研究擬對(duì)RVVC、VVC患者的陰道致病白假絲酵母菌對(duì)6種臨床常用抗真菌藥物的體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行藥物外排泵相關(guān)蛋白-多藥耐藥基因MDR1、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族CDR1、CDR2和PDR1基因表達(dá)的檢測(cè)。探討RVVC、VVC患者陰道致病白假絲酵母菌的藥物敏感性差異對(duì)于耐藥相關(guān)基因的表達(dá)水平之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 所有菌株均來(lái)自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診。患者有明顯外陰瘙癢、白帶增多、紅斑、豆腐渣樣或凝乳狀白帶癥狀，且鏡檢可見(jiàn)假絲酵母菌芽生孢子或假菌絲為鏡檢陽(yáng)性。經(jīng)分離、以VITEK 2系統(tǒng)鑒定菌種為白假絲酵母菌菌株213株，其中VVC 137株，RVVC 76株?；颊呔懦庖呦嚓P(guān)疾病、糖尿病或使用免疫抑制劑，無(wú)長(zhǎng)期使用抗生素病史。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 使用FUNGUS-7藥敏試劑盒對(duì)兩性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑、伊曲康唑、氟康唑這6種藥進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。(1)從培養(yǎng)基上挑取所分離的單個(gè)菌落的酵母菌，加入eppendorf管，加生理鹽水調(diào)成相當(dāng)于2號(hào)麥?zhǔn)瞎艿臐岫龋?2)用加液槍吸取100μl細(xì)菌培養(yǎng)液加至Neg孔中，作為敏感(不生長(zhǎng))對(duì)照；(3)用加液槍吸取100μl用生理鹽水調(diào)制好的菌液，加入培養(yǎng)液中，充分混勻；(4)每孔加100μl(Neg孔除外)，35℃孵育18～24h；(5)取出條板，每孔加顯色液1滴，10min后肉眼判讀結(jié)果。

1.2.2 耐藥基因的表達(dá) (1)RNA提取:將37℃過(guò)夜培養(yǎng)的相同量白假絲酵母菌菌落溶于1mol/L山梨醇、0.1mol/L MEDTA的液體中，使溶液OD600在0.6～1.0，置1.5ml eppendorf管中，加0.1%β-巰基乙醇和50個(gè)單位溶壁酶，25℃處理24h。破壁后清亮溶液置4℃，5000r/min離心5min，棄上清得到白色細(xì)胞團(tuán)。使用Ultrapure RNA Kit(中國(guó)康為世紀(jì)公司)按說(shuō)明書(shū)提取假絲酵母菌總RNA。(2)RNA逆轉(zhuǎn)錄:使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京Transgen公司)進(jìn)行cDNA合成。反應(yīng)體系為20μL，包含7μL RNA，1μL Anchored Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μL)，10μL 2×TS Reaction Mix,1μL TranScript RT/RI Enzyme Mix,1μL gDNA Remover。42℃孵育30min。得到的cDNA置-20℃冰箱保存。(3)參考GenBank設(shè)計(jì)CDR1、CDR2、MDR1、PDR1引物，MDR1和內(nèi)參基因的引物18SrRNA為內(nèi)參基因引物序列，見(jiàn)表1。(4)PCR反應(yīng)體系為15μL，包括2×UltraSYBR Mixture 7.5μL，RNase-Free Water 4.3μL，Template DNA 2μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，設(shè)置參數(shù)為95℃預(yù)變性10min，95℃ 40個(gè)循環(huán)15s，60℃退火1min。以每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Cycle threshold，Ct值)來(lái)定量計(jì)算基因表達(dá)的效果。

表1 引物基因序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件包，對(duì)于耐藥基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；對(duì)于耐藥基因表達(dá)量比較，把Ct值轉(zhuǎn)化為2-Ct后取管家基因18SrRNA與目標(biāo)基因表達(dá)的差值，以方差分析或t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏結(jié)果 對(duì)137株VVC白假絲酵母菌菌株和76株RVVC菌株進(jìn)行兩性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑、伊曲康唑、氟康唑藥敏試驗(yàn)，見(jiàn)表2。

2.2 耐藥基因表達(dá)結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)菌株均有CDR1、CDR2和MDR1基因產(chǎn)物的表達(dá)，但PDR1僅在部分菌株中表達(dá)。76株RVVC致病白假絲酵母菌中，表達(dá)PDR1基因的菌株有15株，其余61株無(wú)表達(dá)，表達(dá)率為19.74%；137株VVC致病白假絲酵母菌中，表達(dá)PDR1基因的菌株有41株，其余96株無(wú)表達(dá)，表達(dá)率為29.93%。RVVC組的PDR1基因表達(dá)率明顯低于VVC組(P<0.05)。

76株RVVC致病白假絲酵母菌中，兩性霉素B僅檢出一株中敏菌株，未檢出耐藥菌株，且敏感組只有一株菌株表達(dá)PDR1基因，制霉菌素未檢出中敏、耐藥菌株組的，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，故只分析其余5種藥物敏感、中敏、耐藥菌株組的CDR1、CDR2、PDR1和MDR1基因表達(dá)量的情況；5種藥物中，兩性霉素B、益康唑的耐藥菌株僅為1～3株，與中敏菌株合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示:益康唑的RVVC-I+R組菌株CDR1、CDR2和MDR1基因表達(dá)量與RVVC-S組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；伊曲康唑、氟康唑的RVVC-R組MDR1基因表達(dá)量較RVVC-S組和RVVC-I組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其余幾種藥物的RVVC-S組、RVVC-I組和RVVC-R組菌株的CDR1、CDR2、PDR1、MDR1基因表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

137株VVC致病白假絲酵母菌中，兩性霉素B、咪康唑僅檢出一株耐藥菌株，與中敏菌株合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示:咪康唑不同敏感性菌株的CDR1基因表達(dá)在VVC-I+R組表達(dá)高于VVC-S組(P<0.05)；氟康唑不同敏感性菌株的CDR1基因表達(dá)在VVC-I組表達(dá)高于VVC-S組和VVC-R組(P<0.05)，但VVC-S組和VVC-R組無(wú)顯著差異(P>0.05)。5-氟胞嘧啶和氟康唑的VVC-R組菌株的CDR2基因表達(dá)量與其VVC-S組和VVC-I組無(wú)顯著差異(P>0.05)；伊曲康唑的VVC-R組CDR2和MDR1基因表達(dá)量與VVC-S組和VVC-I組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

進(jìn)一步比較RVVC和VVC患者致病白假絲酵母菌株中不同抗真菌藥物的敏感、中敏、耐藥菌株組CDR1、CDR2、PDR1、MDR1基因表達(dá)量的差異，結(jié)果顯示:兩性霉素B的PDR1基因表達(dá)VVC-R組高于VVC-I組(P<0.05)；伊曲康唑的RVVC-R組的PDR1表達(dá)量顯著高于VVC-S組、VVC-R組和RVVC-S組(P<0.05)，而VVC-S組、VVC-R組和RVVC-S組無(wú)明顯差異(P>0.05)。其余各組MDR1、CDR1、CDR2和PDR1基因表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RVVC、VVC不同藥物敏感、中敏、耐藥菌株MDR1、CDR1、CDR2和PDR1基因表達(dá)量情況,見(jiàn)表3。

表2 VVC組與RVVC組白假絲酵母菌藥敏結(jié)果

表3 VVC組與RVVC致病菌株CDR1、CDR2、PDR1、MDR1與內(nèi)參基因18SrRNA表達(dá)比較

3 討 論

VVC患者的致病菌是以白假絲酵母菌為主。目前RVVC患者的主要致病菌是白假絲酵母菌，但是非白假絲酵母菌的構(gòu)成日益增加，如光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌等[5]。RVVC容易復(fù)發(fā)，不易根治，成為臨床治療的難點(diǎn)，這主要與RVVC患者的一些不良生活習(xí)慣、患糖尿病、免疫抑制和個(gè)體免疫差異有關(guān)[6-8]。目前認(rèn)為，白假絲酵母菌的耐藥機(jī)制與多種耐藥基因的表達(dá)及其基因多態(tài)性有關(guān)，包括唑類藥物作用靶酶編碼基因ERG11堿基位點(diǎn)突變導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)及功能的改變、編碼藥物外排泵基因表達(dá)增加和某些耐藥基因的表達(dá)、假絲酵母菌細(xì)胞膜的變化及生物膜形成等[9]。唑類藥的藥物外排泵基因表達(dá)異常被認(rèn)為是唑類對(duì)假絲酵母菌屬耐藥的主要機(jī)制之一[10]。假絲酵母菌耐藥為編碼外排泵ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的白色假絲酵母菌耐藥基因1(candida albicans drug resistance gene,CDR1)和白色念珠菌耐藥基因2(candida albicans drug resistance 2,CDR2)。CDR1、CDR2和編碼主要易化擴(kuò)散載體超家族的多重耐藥基因1(multiple drug resistance gene 1,MDR1)的過(guò)表達(dá),藥物外排泵對(duì)抗真菌藥物的外排能力增強(qiáng)導(dǎo)致胞內(nèi)藥物濃度降低,可能是白色念珠菌最主要的耐藥機(jī)制之一。PDR1是釀酒酵母同源的假絲酵母菌的外排泵基因，主要在光滑假絲酵母菌中表達(dá)[11]。

本研究對(duì)兩組白假絲酵母菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)后，對(duì)213株致病白假絲酵母菌菌株進(jìn)行了MDR1、CDR1、CDR2和PDR1基因的qPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示CDR1、CDR2和MDR1耐藥基因在所有致病白假絲酵母菌中均有表達(dá)，白假絲酵母菌有PDR1的表達(dá)，但并不是所有菌株都表達(dá)。76株RVVC致病白假絲酵母菌中，PDR1表達(dá)率為19.74%；137株VVC致病白假絲酵母菌中，PDR1表達(dá)率為29.93%；RVVC組PDR1基因表達(dá)率明顯低于VVC組(P<0.05)。在對(duì)RVVC和VVC的比較中，兩性霉素B的VVC中敏、耐藥合并組(I+R組)的PDR1表達(dá)率構(gòu)成比明顯高于VVC-S和RVVC-S組(P<0.05)。Whaley等[11]通過(guò)由于編碼轉(zhuǎn)錄因子PDR1的基因突變而導(dǎo)致多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)度表達(dá),導(dǎo)致光滑念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥。目前鮮有報(bào)道對(duì)白假絲酵母菌PDR1的檢測(cè)并分析其耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，致病的白假絲酵母菌只有部分表達(dá)PDR1，并且在VVC中占的比例較大。提示PDR1基因在抗真菌藥物不同敏感性菌株中的表達(dá)率存在一定差異，其在一些耐藥菌株中的表達(dá)率增高，并驗(yàn)證了PDR1不僅是光滑假絲酵母菌耐藥相關(guān)基因。耐藥組PDR1基因的表達(dá)率和表達(dá)量均有所增加，PDR1基因可能是RVVC、VVC患者陰道致病白假絲酵母菌耐藥的相關(guān)基因。推測(cè)PDR1可能對(duì)白假絲酵母菌的耐藥起到一定的作用，但不是主要作用。

本研究通過(guò)比較RVVC和VVC患者致病白假絲酵母菌株中不同抗真菌藥物的敏感、中敏、耐藥菌株組CDR1、CDR2和MDR1基因表達(dá)量的差異，結(jié)果提示:RVVC和VVC患者致病白假絲酵母菌中，咪康唑和氟康唑的中敏、耐藥菌株的CDR1基因表達(dá)明顯較敏感菌株增高(P<0.05)，CDR1基因可能是RVVC、VVC患者陰道致病白假絲酵母菌耐藥的相關(guān)基因。這與羅妙玲等[12]關(guān)于CDR1基因的報(bào)道一致。譚皓妍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，某些白假絲酵母菌為多重耐藥，而CDR1及CDR2高表達(dá)的白假絲酵母菌菌株與氟康唑耐藥有關(guān),與酮康唑或咪康唑耐藥無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在VVC致病白假絲酵母菌中，咪康唑不同敏感性菌株CDR1基因表達(dá)VVC-I+R組顯著高于VVC-S組(P<0.05)；氟康唑VVC-I組CDR1基因表達(dá)顯著高于VVC-S組和VVC-R組(P<0.05)。在RVVC致病白假絲酵母菌中，各組的CDR1、CDR2、和MDR1基因表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，CDR1高表達(dá)可能參與了氟康唑和咪康唑的耐藥，但尚未發(fā)現(xiàn)CDR2和MDR1在耐藥菌株中的表達(dá)差異，這可能與樣本量小有關(guān)。白假絲酵母外排泵基因表達(dá)特別復(fù)雜，對(duì)于CDR1、CDR2、MDR1和PDR1這幾個(gè)外排泵基因，在耐藥菌株中不一定同時(shí)表達(dá),且與白假絲酵母菌對(duì)不同藥物的耐藥性相關(guān)[14]。研究顯示，CDRs基因的一些改變導(dǎo)致使其表達(dá)量不均衡，如FLO8的缺失、H741D和Q1005H的基因突變[15-17]。

致VVC的白假絲酵母菌的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，耐藥相關(guān)基因CDR1、CDR2、PDR1和MDR1并不是耐藥菌株特有的表達(dá)基因，它是一個(gè)多因素調(diào)節(jié)造成的結(jié)果，但在非耐藥和耐藥組之間的表達(dá)存在差異。并不是所有耐藥基因都同時(shí)參與耐藥，也非耐藥一定就是外排泵高表達(dá)導(dǎo)致的。致VVC和RVVC的菌株之間并不是單純的多次感染后必然耐藥的關(guān)系。目前認(rèn)為,陰道局部免疫功能異常可能與VVC和RVVC的發(fā)生密切相關(guān)[18]。故耐藥基因的表達(dá)增加可能只是VVC和RVVC致病菌株耐藥性產(chǎn)生原因之一。