基于藻類(lèi)光合作用抑制效應(yīng)的敵草隆毒性響應(yīng)參數(shù)研究

胡 麗，陳 敏，殷高方，趙南京，甘婷婷

1.合肥師范學(xué)院物理與材料工程學(xué)院，安徽 合肥 230061 2.中國(guó)科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所中科院環(huán)境光學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031 3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生院科學(xué)島分院，安徽 合肥 230026

引 言

隨著現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，各種各樣除草劑被過(guò)量使用，大量殘存的除草劑進(jìn)入水環(huán)境中，給流域生態(tài)環(huán)境、水產(chǎn)養(yǎng)殖和飲水安全帶來(lái)巨大威脅[1]。區(qū)別理化分析方法，水質(zhì)生物毒性檢測(cè)方法利用生物在脅迫條件下的生理或行為等變化衡量污染物毒性，能綜合反映污染物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的危害程度，滿足生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需求[2]。藻類(lèi)作為單細(xì)胞生物，其個(gè)體小、繁殖快、對(duì)毒物敏感、易于培養(yǎng)，是水質(zhì)生物毒性檢測(cè)的理想受試生物[3]，國(guó)際經(jīng)合組織將“藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”列為化學(xué)品毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)方法，以96h作用下藻類(lèi)細(xì)胞密度生長(zhǎng)的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度(EC50)來(lái)表征急性毒性作用的程度。然而，“藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”依賴(lài)于藻類(lèi)細(xì)胞的繁殖代謝過(guò)程，毒性響應(yīng)慢，測(cè)量周期長(zhǎng)[4]，已有研究表明細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞酶活性變化、遺傳物質(zhì)損傷等抑制細(xì)胞生長(zhǎng)因素都會(huì)作用于光合作用過(guò)程[5]，其響應(yīng)速度和靈敏度明顯優(yōu)于“藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”[6]。近年來(lái)，人們開(kāi)展了一些污染物毒性的藻類(lèi)光合抑制實(shí)驗(yàn)，熒光測(cè)量多跟隨國(guó)外技術(shù)(如PAM[7])，獲得的光合熒光參數(shù)大多與可變熒光Fv或最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm有關(guān)。已有研究也多選用Fv或Fv/Fm表征藻類(lèi)受脅迫程度[8]，如Mallick等[9]實(shí)驗(yàn)證明(F0/Fv)是評(píng)估重金屬毒性的最佳參數(shù)；Pérez等[10]研究認(rèn)為可變熒光(Fv)對(duì)Cu2+脅迫響應(yīng)最為快速敏感；Tiam等[11]研究表明快速光響應(yīng)曲線的反演參數(shù)Yield(光照狀態(tài)下PSⅡ的實(shí)際量子產(chǎn)量)對(duì)農(nóng)藥毒性更敏感，是較好的藻類(lèi)生物毒性反應(yīng)終點(diǎn)。然而，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型污染物對(duì)藻類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)的光合作用位點(diǎn)和損傷程度具有明顯差異，與之對(duì)應(yīng)的敏感熒光參數(shù)差異較大[12]?，F(xiàn)有研究采用單一、固定的光合熒光參數(shù)作為生物毒性反應(yīng)終點(diǎn)，缺乏對(duì)多個(gè)光合熒光參數(shù)響應(yīng)敏感性的對(duì)比分析，造成生物毒性定量檢測(cè)的靈敏度不高。因此，針對(duì)特定污染物(如除草劑)，在準(zhǔn)確獲得多個(gè)光合熒光參數(shù)的基礎(chǔ)上，如何從眾多的光合熒光參數(shù)中篩選出能夠精確反映其抑制效應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)，成為當(dāng)前該領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。

本研究以蛋白核小球藻為受試對(duì)象，以葉綠素?zé)晒庾鳛樵孱?lèi)光合作用狀態(tài)快速無(wú)損探針，采用熒光動(dòng)力學(xué)手段測(cè)量藻類(lèi)光合熒光參數(shù)，對(duì)典型除草劑敵草隆(dichlorophenyl dimethylurea，DCMU)抑制下的多個(gè)光合熒光參數(shù)的毒性響應(yīng)敏感性進(jìn)行對(duì)比分析，得到適用于快速、定量評(píng)價(jià)DCMU脅迫效應(yīng)的關(guān)鍵光合參數(shù)，提高DCMU生物毒性檢測(cè)的速度和靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藻種培養(yǎng)與溶液配制

實(shí)驗(yàn)選取的蛋白核小球藻選種及擴(kuò)大培養(yǎng)方法同參考文獻(xiàn)[8]，實(shí)驗(yàn)在100 mL三角錐形瓶中進(jìn)行，量取藻液50 mL，實(shí)驗(yàn)藻類(lèi)初始葉綠素濃度控制在100～200 μg·L-1，DCMU脅迫物的添加體積為1 mL(排除藻液稀釋造成的干擾)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DCMU抑制液濃度梯度設(shè)定為1，2，5，10，20，40，80和160 μg·L-1，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2 光合熒光參數(shù)及獲取

藻類(lèi)光合熒光參數(shù)通過(guò)可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x(AGHJ-TPLIF-I，中國(guó)科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所研制)測(cè)量[13]。該儀器通過(guò)測(cè)量水體藻類(lèi)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線及光合響應(yīng)曲線(FLC曲線)，能夠在數(shù)十秒內(nèi)準(zhǔn)確反演獲得表征藻類(lèi)光合作用過(guò)程特征的光合熒光參數(shù)，儀器主要功能結(jié)構(gòu)如圖1所示，得到的光合熒光參數(shù)如表1所示。

圖1 可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of chlorophyll fluorescence analyzer induced by variable light pulse

表1 可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x測(cè)量得到的光合熒光參數(shù)Table 1 Photosynthetic fluorescence parameters acquired by the chlorophyll fluorescence analyzer

光合熒光參數(shù)對(duì)DCMU的響應(yīng)結(jié)果以抑制率和促進(jìn)率表征，分別用Y抑制和Y促進(jìn)表示，其計(jì)算公式見(jiàn)式(1)和式(2)[14]

(1)

(2)

式中，X0為對(duì)照組光合熒光參數(shù)數(shù)值；Xi為實(shí)驗(yàn)組光合熒光參數(shù)數(shù)值。

2 結(jié)果與討論

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取DCMU脅迫5 min后的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組12個(gè)光合熒光參數(shù)，利用成對(duì)樣本T檢驗(yàn)得到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的顯著性差異，初步篩選有顯著性響應(yīng)的參數(shù)。結(jié)果表明，DCMU在蛋白核小球藻的多個(gè)光合作用位點(diǎn)都產(chǎn)生了抑制，10個(gè)光合熒光參數(shù)F0，F(xiàn)m，σPSⅡ，τQA，F(xiàn)v，F(xiàn)v/Fm，Yield，rP，NPQ，α存在顯著性差異；JVPⅡ和Ek在測(cè)量濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)了中濃度區(qū)域顯著響應(yīng)，但低濃度和高濃度區(qū)域非顯著性響應(yīng)，不適宜作為生物毒性定量檢測(cè)的響應(yīng)指標(biāo)。因此，選取上述10個(gè)顯著響應(yīng)參數(shù)，進(jìn)一步研究DCMU毒性作用下的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.1 時(shí)間效應(yīng)關(guān)系

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)測(cè)試周期設(shè)置為5 min，1 h，3 h，6 h，24 h，48 h，72 h和96 h，得到10個(gè)顯著響應(yīng)參數(shù)在DCMU抑制下的時(shí)間-效應(yīng)變化規(guī)律。同時(shí)，為了比較光合抑制和生長(zhǎng)抑制的差異，以藻類(lèi)葉綠素含量(chlorophyll，Chl，可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x測(cè)量)代替藻類(lèi)生物量，得到DCMU抑制下的藻類(lèi)生物量隨時(shí)間的響應(yīng)規(guī)律。

結(jié)果表明，10個(gè)光合熒光參數(shù)可分為三類(lèi)：第一類(lèi)為表征藻類(lèi)生長(zhǎng)狀態(tài)的參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ，各參數(shù)的時(shí)間-效應(yīng)趨勢(shì)大致相同，如圖2所示。樣液的抑制率在測(cè)量周期內(nèi)呈現(xiàn)出先下降的趨勢(shì)，6 h后抑制率達(dá)到最低值；后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，48 h后基本趨于穩(wěn)定，且此時(shí)的抑制率值基本和5 min的測(cè)量值持平。6 h內(nèi)抑制率下降可能與受試藻類(lèi)毒性脅迫自適應(yīng)有關(guān)，但藻類(lèi)細(xì)胞自適應(yīng)能力達(dá)到極限后，毒性脅迫效應(yīng)將隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，直至穩(wěn)定，這與文獻(xiàn)[8]研究結(jié)果一致。因此，考慮到生物毒性快速測(cè)量需求，可以選擇5 min作為定量測(cè)量的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，此時(shí)的測(cè)量數(shù)據(jù)可以代表長(zhǎng)期(如96 h)抑制效果。

圖2 光合熒光參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ時(shí)間響應(yīng)變化趨勢(shì)Fig.2 The variation trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with time

第二類(lèi)為F0，F(xiàn)m和Fv，結(jié)果如圖3所示。在整個(gè)測(cè)量周期內(nèi)，低濃度樣液呈現(xiàn)出刺激生長(zhǎng)效應(yīng)，在48 h后趨于穩(wěn)定；而中高濃度樣液呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的效應(yīng)，6 h為時(shí)間拐點(diǎn)，之后抑制率隨時(shí)間呈累積增長(zhǎng)效應(yīng)，在48 h后趨于穩(wěn)定，這種先促進(jìn)后抑制的趨勢(shì)類(lèi)似第一類(lèi)參數(shù)，與藻類(lèi)毒性脅迫短期內(nèi)的自適應(yīng)效應(yīng)和脅迫極限有關(guān)。同時(shí)，對(duì)比上述參數(shù)和藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制的時(shí)間響應(yīng)規(guī)律(即chl-a含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì))，發(fā)現(xiàn)其響應(yīng)規(guī)律類(lèi)似，說(shuō)明參數(shù)F0，F(xiàn)m和Fv除了與藻類(lèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)外，還與藻類(lèi)生物總量有關(guān)。因此，第二類(lèi)參數(shù)同藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制方法，適合選取較長(zhǎng)時(shí)間為定量測(cè)量的時(shí)間節(jié)點(diǎn)(如48 h)，以獲得較為穩(wěn)定、精確的測(cè)試結(jié)果。

圖3 光合熒光參數(shù)F0，F(xiàn)m、Fv和Chl時(shí)間響應(yīng)變化趨勢(shì)Fig.3 The variation trend of F0， Fm， Fv and Chl with time

第三類(lèi)為光合參數(shù)σPSⅡ和τQA，此類(lèi)參數(shù)的抑制率值在整個(gè)測(cè)量周期內(nèi)都是負(fù)值，為研究方便，使用促進(jìn)率表征參數(shù)對(duì)DCMU的響應(yīng)規(guī)律，如圖4所示。樣液的促進(jìn)率在6 h內(nèi)呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，6 h后隨時(shí)間延長(zhǎng)累積變化較小，基本趨于穩(wěn)定。因此，可以選擇6 h作為第三類(lèi)參數(shù)毒性測(cè)量的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，確保此時(shí)的測(cè)量數(shù)據(jù)與長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量數(shù)據(jù)保持一致，避免短時(shí)測(cè)量出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。

圖4 光合熒光參數(shù)σPSⅡ和τQA時(shí)間響應(yīng)變化趨勢(shì)Fig.4 The variation trend of σPSⅡ and τQA with time

綜合三類(lèi)參數(shù)的時(shí)間響應(yīng)規(guī)律，考慮到DCMU生物毒性快速測(cè)量的需求，選取5 min作為測(cè)量的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，第一類(lèi)參數(shù)Yield，rp，α，F(xiàn)v/Fm和NPQ作為定量測(cè)量的關(guān)鍵光合參數(shù)，進(jìn)一步研究其劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.2 劑量效應(yīng)關(guān)系

根據(jù)2.1節(jié)，進(jìn)一步分析關(guān)鍵參數(shù)Yield，rp，α，F(xiàn)v/Fm和NPQ在DCMU 5 min抑制時(shí)的劑量效應(yīng)關(guān)系，并與96 h長(zhǎng)時(shí)抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行對(duì)比，以確保短時(shí)測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。通常生物毒性實(shí)驗(yàn)獲取的毒性強(qiáng)度與受試生物受抑制程度間的劑量-效應(yīng)曲線呈現(xiàn)反“S”形，一般以阻滯增長(zhǎng)模型(Logistic)為基礎(chǔ)進(jìn)行非線性擬合[15]。以抑制物濃度代表其毒性強(qiáng)度，光合參數(shù)的抑制率代表受試生物受抑制程度，利用Logistic函數(shù)進(jìn)行擬合，得到對(duì)應(yīng)的擬合相關(guān)系數(shù)及EC50值。結(jié)果顯示，DCMU抑制5 min后，參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ抑制率對(duì)DCMU濃度具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系(如圖5)，擬合相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996 9，0.997 3，0.998 5，0.998 5和0.998 5，由此得到的EC50-5 min值分別為10.31，11.59，13.03，13.94和2.41 μg·L-1，如表2所示。對(duì)比96 h長(zhǎng)時(shí)抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果表明參數(shù)Yield，rp，α，F(xiàn)v/Fm的擬合相關(guān)系數(shù)短時(shí)效應(yīng)優(yōu)于長(zhǎng)時(shí)效應(yīng)，但EC50值長(zhǎng)時(shí)效應(yīng)優(yōu)于短時(shí)效應(yīng)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還表明參數(shù)NPQ對(duì)DCMU毒性的響應(yīng)靈敏度和響應(yīng)速度極佳，其5 min抑制對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)和EC50優(yōu)于其他四個(gè)參數(shù)，且優(yōu)于96h的測(cè)量結(jié)果。因此，可以選取參數(shù)NPQ作為5min定量測(cè)量DCMU生物毒性的響應(yīng)指標(biāo)，既可大幅縮短檢測(cè)時(shí)間，還可以提高檢測(cè)的靈敏度。

表2 5 min和96 h抑制的擬合相關(guān)系數(shù)和EC50值Table 2 The fitting correlation coefficient and EC50 value of 5 min and 96 h inhibition

圖5 5 min脅迫下α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ值隨DCMU濃度的變化趨勢(shì)Fig.5 The trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with DCMU concentration under 5 min stress

3 結(jié) 論

基于藻類(lèi)光合熒光參數(shù)的生物毒性監(jiān)測(cè)方法，具有響應(yīng)快速、參數(shù)豐富、測(cè)量簡(jiǎn)捷的特點(diǎn)。對(duì)DCMU抑制下的多個(gè)光合熒光參數(shù)毒性響應(yīng)敏感性進(jìn)行了對(duì)比分析，首先通過(guò)成對(duì)樣本T檢驗(yàn)，得到光合熒光參數(shù)F0，F(xiàn)m，σPSⅡ，τQA，F(xiàn)v，F(xiàn)v/Fm，Yield，rP，NPQ，α顯著響應(yīng)；通過(guò)分析顯著響應(yīng)參數(shù)的時(shí)間-效應(yīng)規(guī)律，得到參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ在5 min即體現(xiàn)出類(lèi)似長(zhǎng)時(shí)抑制效應(yīng)的關(guān)系，5 min可作為DCMU毒性分析的時(shí)間測(cè)量節(jié)點(diǎn)；最后，研究5 min脅迫下DCMU濃度與參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield，NPQ抑制率之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系，利用Logistic函數(shù)進(jìn)行擬合，同時(shí)對(duì)比96 h長(zhǎng)時(shí)抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果顯示參數(shù)NPQ的相關(guān)系數(shù)和EC50分別為0.998 5和2.41 μg·L-1，顯著優(yōu)于其他四個(gè)參數(shù)，且優(yōu)于96 h的測(cè)量結(jié)果。因此，采用光合熒光參數(shù)NPQ作為5 min定量測(cè)量DCMU生物毒性的反應(yīng)終點(diǎn)，可極大縮短DCMU生物毒性檢測(cè)的檢測(cè)時(shí)間(從數(shù)小時(shí)縮短至5 min)，并顯著提高檢測(cè)靈敏度(與光合抑制方法常規(guī)參數(shù)Fv/Fm相比，EC50降低了81.4%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基于藻類(lèi)光合抑制效應(yīng)的DCMU生物毒性定量檢測(cè)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，研究方法也為其他污染物脅迫下的藻類(lèi)光合熒光參數(shù)篩選提供了參考。