雞骨常山根中的一個新吲哚生物堿

賴 奇，段云鳳，馬燕華，楊春菊，莊 敏，呂 典，尹俊林，曾廣智

云南民族大學民族醫(yī)藥學院 民族藥資源化學國家民委教育部重點實驗室，昆明 650500

夾竹桃科(Apocynaceae)是熱帶區(qū)植物主要類型之一，全世界大約有250屬，2 000余種，廣泛分布在亞熱帶與熱帶地區(qū)。雞骨常山(AlstoniayunnanensisDiels)為夾竹桃科雞骨常山屬直立灌木。該屬植物還有大葉糖膠樹，巖生羊角棉，糖膠樹，黃花羊角棉，羊角棉[1]。其中雞骨常山為中國特有種，主要分布于云南省[2]，貴州省，廣西等地。民間常用其根治頭痛、發(fā)熱、降壓，外用具有消腫的作用。雞骨常山化學成分主要為單吲哚類生物堿，如利血平、蛇根精、霹靂蘿芙因等[3-7]。宮頸癌為威脅女性健康的重要疾病，是人類面臨的重大公共安全衛(wèi)生問題[8]。天然產物中不乏抗腫瘤藥物的明星分子，如紫杉醇類、長春花類化合物[9]。本課題組，在前期的調查研究中發(fā)現，雞骨常山根的總堿具有一定的抗腫瘤作用[10,11]，為了從中發(fā)掘活性較好的單體化合物，我們對雞骨常山的根部開展了化學成分研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器和試劑

核磁共振儀BrukerAV400MHz(Bruker，美國)；1810傅里葉(KBr壓片)變換紅外光譜儀(尼高力，美國)；X-4顯微熔點測試儀(鞏義市予華儀器有限責任公司，中國)；Autopol V plus魯道夫高精度旋光儀(魯道夫，美國)；Sephadex LH-20凝膠柱色譜(GE Healthcare，美國)；柱色譜級使用硅膠(100～200、200～300、300～400目)及GF254 薄層色譜硅膠板(青島海洋化工廠，中國)；Waters AutoSpec Premier P776高分辨磁質譜儀(Waters，美國)；提取和分離過程中所涉及到的化學試劑均為分析純(上?？萍脊煞萦邢薰?，中國)。Thermo Scientific 3425二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國)；Molecular devices Spectra Maxi3x 型酶標儀(Molecular devices，美國)，Agilent 6420 三重四極桿LC-MS(Agilent，美國)；DMEM高糖完全培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺Glutamine均購買于(Biological Industries，以色列)；磺羅丹明B(SRB)(上海阿拉丁試劑有限公司，中國)。

1.2 材料

藥材雞骨常山產自云南臨滄市永德縣，經昆明采智公司采集植物樣品并進行鑒定，植物標本保存于云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室。細胞Hela(人宮頸癌細胞)源至于中國科學院的上海細胞庫。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

干燥的雞骨常山根2.91 kg，經過粉碎加工后，用95%工業(yè)甲醇冷浸提取3次。將3次甲醇提取液通過減壓濃縮合并，得到根部的浸膏為150 g。將該浸膏混懸于適量的水中，先用適量分析純石油醚萃取得到石油醚部分15 g，后用冰醋酸將混懸液體調至pH為3～4，使用分析純的乙酸乙酯萃取得到A部分32 g，再用氨水將萃取后的混懸液調至pH為10左右，分析純乙酸乙酯萃取得到B部分為7.2 g。將B部分用60～100目硅膠50 g拌樣然后進行硅膠柱正向柱色譜，洗脫劑的梯度系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯(50∶1)至純乙酸乙酯再到二氯甲烷-甲醇(50∶1)到純甲醇，TLC檢測后合并極性大概相同組分，合并后得到了5個組分，分別標記為Fr.1～Fr.5。取Fr.1部分(1.2 g)用正相硅膠柱進行色譜分離，按照石油醚-乙酸乙酯(30∶1→10∶1)作為流動相梯度洗脫，每200 mL一個餾分，經TLC檢測后合并展板位置相同組分，得到化合物2(120 mg)。Fr.2經正相硅膠柱及Sephadex LH-20色譜分離，再進一步經硅膠柱色譜柱分離純化得化合物5(100 mg)。Fr.3部分純甲醇溶解經純甲醇體系凝膠分離后，再用硅膠柱色譜分離，流動相為乙酸乙酯，得化合物3(400 mg)。Fr.4部分用硅膠色譜分離，流動相為氯甲(50∶1→10∶1)，再經過HPLC甲醇-水(50∶50→40∶60)30 min得到化合物1(23 mg)和化合物4(12 mg)，見圖1。

圖1 雞骨常山中分離得到的化合物

2.2 抗腫瘤活性篩選

選擇對數生長期的Hela細胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基制成懸液，每孔5 000細胞均勻接種于96孔板板中，每孔體積100 μL，培養(yǎng)24 h至細胞完全貼壁。將分離得到的化合物用DMSO配置成10 mM的儲備液，細胞貼壁后每孔加入相應濃度待測化合物繼續(xù)培養(yǎng)48 h。完成培養(yǎng)后，每孔添加20%三氯乙酸25 μL在4 ℃冰箱固定1 h，去除固定液，室溫1%磺酰羅丹明B(SRB)染色1 h，1%醋酸清洗96孔板4次，自然風干24 h后每孔添加10mM的Tris溶液100 μL至完全溶解，然后在多功能酶標儀490～520 nm波長處檢測其OD值，并用GraphPad Prism 8對數據進行統(tǒng)計分析，并作出圖表。實驗獨立重復3次，每組6個副孔。

3 實驗結果

3.1 化合物結構鑒定

化合物1白色固體(甲醇)，HR-ESI-MS：m/z352.201 9[M+H]+(calcd for C21H26N3O2，352.202 0)，推測該化合物分子式為C21H25N3O2，不飽和度為11；熔點為278～282 ℃；旋光度為0。IR(KBr)：3 413、2 361、1 638、1 618、1 400、1 262、1 121、1 067、953、617、515 cm-1；紅外光譜顯示該化合物含有氨基(3 413 cm-1)和酯羰基官能團(1 638 cm-1)，吲哚環(huán)(1 618、1 400 cm-1)?；衔?的13C NMR和DEPT譜顯示該物質含有21個碳，分別為2個甲基(其中一個為乙酰基上的甲基δ22.8，一個末端甲基信號δ12.9)，3個亞甲基(δ28.3、34.6、56.5)，10個次甲基(δ28.6、46.8、51.5、57.0、76.6、111.9、118.3、118.7、119.8、122.1)，6個季碳(δ104.2、128.7、130.3、135.0、138.6、173.3)。化合物1與文獻報道的vellosiminol[12]相比較，兩者波譜數據極為相似，具有單萜吲哚生物堿的特征，推測該化合物為一個具有(5、15)橋環(huán)單萜吲哚生物堿；這兩個化合物不同之處在于∶化合物1在C-17上連接有一個乙?；?δ173.3、22.8)和一個氨基(IR：3 413 cm-1)，根據Scifinder檢索，推測該化合物為新的單萜吲哚生物堿。由于提取分離過程中使用了氨水和乙酸，同時天然產物中氮氧雜縮醛類化合物較少[13,14]，因此推測化合物1可能為分離過程中化合物5和氨水乙酸反應得到的產物。

表1 化合物1的NMR數據(400 MHz，CDCl3)

在化合物1的1H-1HCOSY譜中(圖2)，H3-18與H-19相關說明C-18與C-19相連接；H-17與H-16相關說明C-17和C-16相連。而H2-14與H-3和H-15相關，說明C-3，C-14和C-15彼此相連。H-5與H2-6相關，說明C-5與C-6相連。H-16與H-5和H-15相關，說明C-16與C-15和C-5相連。在化合物1的HMBC譜中(圖2)，H3-18(δ1.5)甲基質子信號與季碳C-20(δ135.0)和C-19(δ118.3)信號相關，說明C-18與C-19和C-20彼此相連接；H3-2′(δ1.5)甲基質子信號和羰基碳C-1′(δ173.3)信號相關，說明C-2′和C-1′相連接。H-17(δ5.0)信號與C-1′(δ173.3)信號相關，說明C-17通過氧原子與C-1′相連。H-17(δ5.0)信號還與C-16(δ46.8)信號相關說明C-17和C-16相連。H-9(δ7.4)信號與次甲基信號C-8(δ138.6)、C-7(δ104.2)信號相關，所以C-9和C-8相連，C-8和C-7相連。為了確定化合物1相對立體構型，測定了化合物1的NOESY相關圖譜(圖2)，在化合物1的NOESY相關圖譜(圖2)中，H-3與H-15相關，H-3與H-16相關，H-16與H-15相關，說明這些質子朝向相同，定義為β構型，H-5和H-15或H-3無直接相關，因此H-5朝向定義為α構型，這種結構，環(huán)系張力最小。H-19的耦合常數為6.7，化合物vellosiminol[12]耦合常數為7，兩者幾乎一致，說明該烯烴(C-19、C-20)為順式構型?；衔?的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1的主要1H-1H COSY、HMBC、NOESY相關

化合物2白色或微黃色固體;分子式C21H24N2O3，ESI-MS：m/z352[M]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.90(1H，s，N-H)，7.57(1H，s，H-17)，7.44(1H，d，J= 7.6 Hz，H-9)，7.20(1H，d，J= 7.6 Hz，H-12)，7.14～7.05(2H，m，H-10，11)，4.53～4.47(1H，m，H-19)，3.75(3H，s，H-23)，3.35(1H，d，J= 11.5 Hz，H-3)，3.11(1 H，dd，J= 12.3，1.9 Hz，H-21)，2.99～2.88(6H，overlap，H-5，6，15，21)，2.58～2.50(2H，overlap，H-5，14)，1.70(1H，m，H-20)，1.54(1H，dd，J= 24.6，12.1 Hz，H-14)，1.41(3H，d，J= 6.2 Hz，H-18)；13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：168.0(C-22)，155.8(C-17)，135.9(C-13)，134.5(C-2)，127.1(C-8)，121.3(C-11)，119.3(C-10)，118.0(C-9)，110.8(C-12)，109.5(C-16)，108.0(C-7)，72.5(C-19)，59.8(C-3)，56.2(C-21)，53.5(C-5)，51.2(C-23)，38.3(C-20)，34.1(C-14)，31.4(C-15)，21.7(C-6)，18.5(C-18)。以上數據與文獻報道一致[15]，鑒定其為tetrahydroalstonine。

化合物3透明油狀;分子式C21H22N2O2，ESI-MS：m/z335[M+H]+，1H NMR(400 MHz， CDCl3)δ：7.62(1H，d，J= 7.7 Hz，H-9)，7.45(1H，d，J= 6.9 Hz，H-12)，7.39(1H，td，J= 7.7，1.3 Hz，H-11)，7.22(1H，td，J= 7.5，1.0 Hz，H-10)，5.31(1H，q，J= 6.7 Hz，H-17)，2.17(3H，s，H-16)，1.67(3H，d，J= 6.7 Hz，H-23)；13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：183.7(C-3)，169.9(C-22)，156.6(C-13)，137.9(C-8)，136.4(C-18)，128.6(C-11)，125.4(C-10)，123.8(C-9)，120.9(C-12)，115.6(C-17)，77.7(C-7)，64.4(C-3)，58.03(C-20)，56.1(C-21)，54.1(C-19)，49.0(C-5)，37.3(C-6)，27.5(C-15)，26.4(C-14)，21.1(C-23)，12.9(C-16)。以上數據與文獻報道一致[16]，鑒定其為vinorine。

化合物4白色固體;分子式C21H24N2O3，ESI-MS：m/z353[M+H]+，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δ：10.46(1H，s，Ar-OH)，8.54(1H，s，N-H)，7.06(1H，d，J= 9.1 Hz，H-12)，6.67(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9)，6.51(1H，dd，J= 9.0，2.1 Hz，H-11)，3.94(2H，d，J= 10.1 Hz，H-17)，1.98(3H，s，H-23)，1.53(3H，d，J= 7.1 Hz，H-18)；13C NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：170.3(C-22)，150.2(C-10)，139.8(C-20)，136.4(C-2)，130.5(C-13)，127.8(C-8)，115.5(C-19)，111.2(C-12)，110.0(C-11)，101.8(C-7)，101.7(C-9)，65.5(C-17)，55.3(C-21)，53.6(C-5)，49.5(C-3)，40.5(C-16)，33.0(C-14)，27.4(C-15)，26.4(C-16)，20.6(C-23)，12.3(C-18)。以上數據與文獻報道的一致[17]，鑒定其為17-acetylsarpagine。

化合物5白色固體:分子式C19H20N2O，ESI-MS：m/z292[M]+，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δ：10.86(1H，s，H-N)，9.57(1H，s，H-17)，7.45(1H，d，J= 8.1 Hz，H-9)，7.34(1H，d，J= 8.1 Hz，H-12)，7.16(1H，J= 7.4 Hz，H-11)，7.10(1H，J= 7.2 Hz，H-10)，5.31(1H，J= 6.8 Hz，H-19)，4.31(1H，d，J= 9.9 Hz，H-3)，3.62(1H，d，J= 17.0 Hz，H-21)，3.50(1H，d，J= 16.7 Hz，H-21)，3.44～3.48(1H，m，H-5)，3.22(1H，d，J= 3.0 Hz，H-5)，2.62(1H，d，J= 15.6 Hz，H-5)，2.57(1H，d，J= 7.6 Hz，H-16)，2.15(1H，t，J= 10.8，1.3 Hz，H-14),2.13(1H，td，J= 11.5，1.5 Hz，H-15)，1.87(1H，d，J= 11.8 Hz，H-14)；13C NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：203.1(C-17)，139.1(C-2)，136.1(C-13)，135.9(C-20)，127.0(C-8)，120.3(C-11)，118.2(C-10)，117.4(C-9)，115.2(C-19)，111.0(C-12)，102.1(C-8)，55.1(C-16)，54.4(C-16)，49.8(C-5)，49.5(C-1)，32.7(C-14)，26.8(C-6)，26.3(C-15)，12.3(C-18)。以上數據與文獻報道一致[18]，鑒定其為vellosimine。

3.2 體外腫瘤細胞毒活性篩選

本實驗對化合物1～5進行了細胞毒活性的篩選，細胞毒活性檢測采用黃酰羅丹明B(SRB)染色法進行測定，測試細胞株為Hela。在100 μmol/L濃度下進行初篩，化合物1、2、4無明顯細胞毒性，而3、5具有較強的細胞毒性，抑制率分別為60.3%±2.5%和85.3%±4.5%，喜樹堿為陽性對照濃度為5 μmol/L。為進一步驗證3、5的細胞毒性，對3、5進行細胞毒活性實驗，實驗結果表明化合物3、5對Hela細胞具有一定的細胞毒性，化合物3IC50為89.4±1.2 μmol/L，化合物5IC50為15.6±0.7 μmol/L，陽性藥物喜樹堿IC50為5.21±1.3 μmol/L。

表2 雞骨常山單體化合物對Hela細胞株毒活性

4 討論與結論

本次研究從雞骨常山根的乙酸乙酯萃取B部分分離得到5個單萜吲哚生物堿，其中化合物1為新的吲哚單萜生物堿，化合物3、5磺酰羅丹明B染色法[19]結果顯示對宮頸癌細胞存在一定程度的細胞毒性及抗腫瘤活性，化合物3對坐骨神經損傷具有一定治療作用[20]，本研究一定程度上豐富了該屬植物的化學成分及其活性的研究內容。宮頸癌為近年來對女性生命健康危害較大的一種疾病，因此找到有效的治療藥物，研究清楚其機理尤為關鍵，下一步擬針對各化合物進一步開展相關的生物活性及機理研究。綜上所述，本研究確定了雞骨常山根具有抗腫瘤活性的吲哚生物堿，對其化學成分展開研究具有一定應用價值，將天然產物與疾病治療聯(lián)系起來，對天然產物開發(fā)與研究具有一定的幫助。