基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討溪黃草黃酮類成分對酒精性肝病的作用機制

鐘景斌，劉文彬，王 暉*

1廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院；2廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006

ALD是指長期飲酒誘發(fā)肝臟出現(xiàn)損傷性的疾病，其以酒精性脂肪肝為表現(xiàn)，可轉(zhuǎn)化為酒精性肝炎、肝纖維化，進一步可惡化為肝硬化，甚至演變?yōu)橥砥诘母渭毎┑认盗屑膊1]。逐年增加的酒精消費量與我國慢性肝病中ALD的發(fā)病率呈正比關(guān)系，而大多數(shù)患者對ALD認識不夠，忽略ALD的危害性，其并發(fā)癥和死亡率較高，亟需成為公眾關(guān)注的健康問題之一。現(xiàn)有研究表明，酒精介導(dǎo)的肝損傷、肝臟脂肪變性、氧化應(yīng)激、腸道菌群介導(dǎo)免疫炎癥、細胞自噬等方面參與ALD發(fā)病機制[2]，但其發(fā)病機制復(fù)雜，尚未完全闡述清楚。目前暫無確切治療ALD的方法及藥物，因此，尋找、開發(fā)治療ALD藥物成為研究的焦點，而中藥在降低ALD的肝功能異常指標與改善患者臨床癥狀中具有廣闊治療前景。

溪黃草為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜Isodonlophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara干燥地上部分，其變種狹基線紋香茶菜、纖花線紋香茶菜或同屬植物溪黃草亦作為溪黃草的來源。溪黃草有清熱利濕、退黃、涼血散瘀功效，治療濕熱黃疸、瀉痢、急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎等疾病。其成分復(fù)雜，二萜類、三萜類、黃酮類等成分是其發(fā)揮抗腫瘤、保肝、利膽、抗氧化、抗菌抗炎、清除自由基等藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。目前，溪黃草的研究主要集中在其水提物對肝損傷、肝纖維化、肝癌等作用研究[4,5]，而對其藥效成分、分子靶點等相關(guān)方面有待深入研究。近年來，黃酮類成分在防治酒精性肝損傷中取得一定進展，溪黃草黃酮能通過增強抗氧化應(yīng)激能力對酒精導(dǎo)致急性肝損傷有預(yù)防保護作用，顯著減輕肝臟病理損傷，降低脂質(zhì)過氧化指標[6]，但缺乏溪黃草黃酮對ALD的分子靶點、通路調(diào)控機制的深入研究，為此，本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)探討溪黃草黃酮類成分治療ALD的作用機理，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 溪黃草黃酮類成分獲取

通過CNKI數(shù)據(jù)庫、PubMed數(shù)據(jù)庫以溪黃草或線紋香茶菜為關(guān)鍵詞進行檢索，通過文獻查對、收集來源于線紋香茶菜植物的溪黃草黃酮類成分，再利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取每個化合物的分子式、CAS號、下載2D結(jié)構(gòu)的SDF文件；進而通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索成分名稱、查對化學(xué)結(jié)構(gòu)式，獲取溪黃草黃酮類成分的口服利用度(oral bioavailability，OB)、類藥性(drug-like，DL)信息，建立溪黃草黃酮類化合物信息數(shù)據(jù)庫。

1.2 溪黃草黃酮類成分靶點反向預(yù)測與篩選

將“1.1”項下得到的每個成分的SDF格式文件導(dǎo)入到PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)獲得溪黃草黃酮類成分潛在的靶點。將獲得的靶點對應(yīng)的PDB ID號通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uploadlists/)中的Retrieve/ID mapping的轉(zhuǎn)化功能，限定物種為人，排除非人源的靶點，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化操作，獲得校正后的基因名稱。

1.3 溪黃草黃酮類成分與ALD的交集靶點獲取

在Genecard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以“alcoholic liver disease”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取ALD疾病的相關(guān)靶點。在該數(shù)據(jù)庫中，Score值越高表示該靶點與疾病相關(guān)程度越高。然后，通過Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將“1.2”項下獲得的溪黃草黃酮類成分預(yù)測靶點經(jīng)去重后與ALD疾病靶點取交集靶點。

1.4 構(gòu)建靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

將“1.3”項的交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中“multiple proteins”選項中，在“organism”處選擇物種來源為人，交互作用大于0.4的靶點，并隱藏游離的節(jié)點，運行后即可得到溪黃草黃酮類成分對ALD作用的PPI網(wǎng)絡(luò)。度值越大代表靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中越處于核心作用，下載STRING數(shù)據(jù)庫的生成有關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)信息的“TSV”文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件，通過Network Analyzer功能進行分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的度值，篩選核心靶點。

1.5 GO與KEGG富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)將交集靶點導(dǎo)入基因列表中，選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”，選定物種為“Homo sapiens”，獲取數(shù)據(jù)對GO功能和KEGG通路進行分析，設(shè)置P<0.05，根據(jù)靶點富集程度進行降序，篩選排名靠前的生物過程和通路，并對數(shù)據(jù)進行可視化。

1.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.1”項的溪黃草黃酮類成分、“1.3”項的交集靶點、“1.5”項的通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建溪黃草黃酮類成分對ALD的作用成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用Network Analyzer功能進行拓撲分析，根據(jù)度值大小篩選排名前5位成分進行分子對接驗證[7]。

1.7 分子對接驗證

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載“1.6”項的度值前5位的黃酮類成分的mol.2文件，建立活性成分配體庫。利用AutoDockTools(1.5.6)對每個成分進行加氫、計算電荷、加Root后保存“pdbqt”格式文件。在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載“1.4”項的核心靶點的度值排名靠前的靶點信息，下載格式為pdb格式，作為核心靶點受體庫。利用PyMol(2.3.4)將靶點蛋白去除配體、水分子后導(dǎo)入AutoDockTools(1.5.6)進行加氫、計算電荷，并保存為“pdbqt”格式文件。由蛋白的配體所處的結(jié)構(gòu)位置為活性口袋，并利用AutoDock Tools確定對接盒子的大小和中心進行分子對接處理，并通過PyMol(2.3.4)進行受體配體的相互作用模式分析。當結(jié)合能<0可以判斷受體配體二者之間自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越低，活性成分越容易與受體結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 溪黃草黃酮類成分收集

通過檢索文獻[8,9]獲得12種來源于線紋香茶菜中的溪黃草黃酮類成分，通過PubChem數(shù)據(jù)庫查找，匹對成分的結(jié)構(gòu)信息，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取每個成分的OB、DL值，如表1所示。帶“*”號的成分由于OB值較低，但部分成分其生物活性較強，藥理作用明確，所以納入構(gòu)建溪黃草黃酮類成分的數(shù)據(jù)庫。如蘆丁具有多種藥理活性，研究證實，其通過減低TGF-β1、IL-1β、結(jié)締組織生長因子和膠原蛋白的表達具有抗肝纖維化，且表明其通過抑制NF-κB活化、促炎細胞因子及Nrf2的釋放、減弱由膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)肝損傷的氧化應(yīng)激[10]。

表1 溪黃草中12個黃酮類成分信息

2.2 溪黃草黃酮類成分靶點

通過PharmMapper、Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取成分靶點信息，經(jīng)刪除無效與重復(fù)靶點，共獲取溪黃草黃酮類成分作用靶點382個。

2.3 交集靶點的收集

通過Genecard數(shù)據(jù)庫的檢索，根據(jù)相關(guān)評分(relevance score)設(shè)置篩選條件為≥5，篩選出4 267個與酒精性肝病相關(guān)的靶點。通過韋恩圖Venny2.1.0繪制獲得172個交集靶點，為溪黃草黃酮類成分治療酒精性肝病潛在的靶點(見圖1)。

圖1 溪黃草黃酮類成分靶點與酒精性肝病靶點的交集靶點

2.4 靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將172個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到成分與疾病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示節(jié)點168個，邊942條，平均節(jié)點度值為11.2。以節(jié)點度值為評價參數(shù)，設(shè)置度值≥23為篩選條件，篩選出24個核心靶點，節(jié)點度值(degree)越大說明其在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要，可能在發(fā)揮生物學(xué)功能中起著重要的作用。使用Cytoscape3.7.0對STRING數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)進行分析，節(jié)點越大，相應(yīng)的度值越大，顏色越紅。并通過Cytoscape3.7.0中的Cytohubba插件篩選出核心靶點。如圖3所示。選取度值排名靠前的核心靶點：HSP90AA1(degree：50)、VEGFA(degree：49)、CCND1(degree：48)作為分子對接驗證的靶點。

圖2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 24個核心靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO與KEGG富集分析

由GO富集結(jié)果得知，在P<0.05條件下，得到生物學(xué)功能條目共有92條，其中涉及生物過程(biological process，BP)為52條，溪黃草黃酮類成分主要參與包括RNA、DNA轉(zhuǎn)錄的正負調(diào)控、細胞凋亡正負調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮生長因子受體信號，Notch信號通路、NF-κB調(diào)節(jié)，Wnt信號通路的調(diào)節(jié)、STAT3蛋白的絲氨酸磷酸化、DNA損傷的內(nèi)在凋亡、細胞周期調(diào)節(jié)、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程，表明溪黃草黃酮類成分作用于ALD主要參與涉及細胞周期調(diào)控、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、炎癥途徑等反應(yīng)。細胞成分(cellular component，CC)富集了24條，主要參與胞外體、細胞表面、焦點粘附、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、Toll樣受體1-Toll樣受體2蛋白復(fù)合物等。分子功能(molecular function，MF)共富集16條目，涉及三磷酸腺苷結(jié)合、鋅離子結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活性、類固醇結(jié)合、受損的DNA結(jié)合、氧化還原酶活性等重要生物功能(見圖4，BP、CC、MF根據(jù)富集基因數(shù)量只展示前10的條目)。由KEGG富集分析得到27條通路(P<0.05)，溪黃草黃酮類成分主要參與多條癌癥通路、PI3K/Akt信號通路、癌癥中的蛋白多糖、病毒致癌作用、乙型肝炎、FoxO信號通路、p53信號通路、細胞周期、PPAR信號通路、丙氨酸/天冬氨酸和谷氨酸代謝等重要通路發(fā)揮作用。如圖5所示對前20條重要通路進行可視化處理。

圖4 關(guān)鍵靶點的GO富集分析

2.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

將12種溪黃草黃酮類成分，172個交集靶點，27條重要通路使用Cytoscape3.7.0構(gòu)建溪黃草黃酮類成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(見圖6)。該網(wǎng)絡(luò)圖包含211個節(jié)點，634條邊，其中12個黃色菱形節(jié)點代表了溪黃草黃酮類成分，172個紅色倒三角形代表了交集靶點，27個深藍色三角形代表重要的通路，邊表示成分、靶點、通路三者之間聯(lián)絡(luò)關(guān)系。根據(jù)度值的大小，篩選出前5個成分作分子對接驗證，分別為vitexin(degree：43)、quercetin(degree：41)、isoschaftoside(degree：40)、vicenin 2(degree：38)、azaleatin(degree：36)。

圖6 溪黃草黃酮類成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對接驗證分析

配體與受體在結(jié)合時，構(gòu)象越穩(wěn)定其能量越低，相互作用的可能性越大。以結(jié)合能≤-5 kJ/mol為判斷相互作用能力的依據(jù)。如表2顯示，5個溪黃草黃酮類成分的結(jié)合能均<0，說明其能與靶點產(chǎn)生自發(fā)性結(jié)合。其中，在HSP90AA1靶點中，5個成分全部與靶點產(chǎn)生較好的結(jié)合特性，而在VEGFA靶點中，只有quercetin與其產(chǎn)生相互作用能力。在CCND1靶點中，quercetin與azaleatin兩種成分的結(jié)合能為-5 kJ/mol，與其產(chǎn)生較好結(jié)合效應(yīng)。從總體上進行推測，分子對接顯示溪黃草黃酮類成分與核心靶點有較好的結(jié)合活性。利用PyMol(2.3.4)將5個配體成分中結(jié)合能最低的成分與3個靶點繪制成分與靶點對接模式圖。Isoschaftoside-HSP90AA1的結(jié)合位點為Asp-93、Leu-107、Tyr-139氨基酸殘基，quercetin-VEGFA通過Glu-23、Gly-52、Leu-25氨基酸殘基發(fā)揮作用效應(yīng)，quercetin-CCND1的結(jié)合位點為Glu-115、Lys-72、Gln-71、Lys-123、Thr-120氨基酸殘基(見圖7)。

表2 部分成分與靶點分子對接結(jié)果

圖7 成分-靶點對接相互作用模式

3 討論

通過對溪黃草黃酮類成分分析，從構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中篩選度值排名前5的成分。其中，牡荊苷為黃酮碳苷類成分，可調(diào)控凋亡信號，最近研究顯示[11]，牡荊苷對酒精誘導(dǎo)肝損傷有保護作用，可能與調(diào)節(jié)Sirt1/p53介導(dǎo)線粒體凋亡途徑減少肝細胞凋亡、降低氧化應(yīng)激和炎癥水平有關(guān)。槲皮素能降低長期攝入酒精導(dǎo)致血清中ALT、AST、TG含量升高，通過降低脂蛋白2(PLIN2)水平，激活A(yù)MPK信號促進脂肪吞噬，表明其對酒精導(dǎo)致的肝脂肪變性有保護作用[12]。由于肝星狀細胞的活化是引起肝纖維化的原因，其通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads和PI3K/Akt通路之間的相互作用來減弱肝星狀細胞的活化，并減少自噬而緩解肝纖維化加重的趨勢[13]。異夏佛塔苷能顯著抑制非小細胞肺癌A549細胞存活率，其抗腫瘤機制與調(diào)控細胞凋亡有關(guān)[14]。新西蘭牡荊苷2能降低肝損傷標志物ALT、AST水平和炎癥因子的表達，抑制MAPK激活、調(diào)控TLR信號通路減輕由LPS誘導(dǎo)肝損傷引起的炎癥反應(yīng)，表明其具有保肝作用[15]。因此，可推測上述的溪黃草黃酮中核心成分通過調(diào)控細胞凋亡、降低氧化應(yīng)激、抗肝纖維化、降低炎癥水平等方面發(fā)揮干預(yù)ALD的潛在作用。

由核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖可知，溪黃草黃酮類成分作用于ALD的靶點有24個核心靶點，并對HSP90AA1、VEGFA、CCND1、IL10、FOXO3等度值較大的靶點進行文獻分析。熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)轉(zhuǎn)導(dǎo)能促進癌癥相關(guān)成纖維細胞慢性炎癥的信號，通過激活NF-κB和STAT3轉(zhuǎn)錄，分泌炎癥細胞因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)能加速ALD的發(fā)展，在酒精性肝硬化中HSP90AA1誘導(dǎo)與NLRP3炎性小體呈正相關(guān)，抑制HSP90AA1進而降低NLRP3炎性體活性使炎癥細胞因子分泌減少，減輕炎癥反應(yīng)[16]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、誘導(dǎo)新血管生成，其與肝細胞癌，尤其是酒精性肝硬化的生理病理有關(guān)。酒精攝入會增加肝臟氧氣的消耗，易誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)的活化，促進VEGFA轉(zhuǎn)錄，引起ALD中肝纖維化的發(fā)生[17]。細胞周期蛋白D1(CCND1)主要功能為促進細胞增殖，但其過度表達可致細胞增殖失控，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。過表達的CCND1與肝細胞癌相關(guān)，而在體外研究表明槲皮素下調(diào)CCND1表達以干擾HepG2細胞的細胞周期和增殖[18]。另外，IL-10是在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中發(fā)揮多效作用的細胞因子，可抑制ALD中炎癥細胞因子LPS、TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，通過減少肝臟炎癥和脂肪變性發(fā)生而保護肝臟[19]。叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3(FOXO3)廣泛參與細胞自噬、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程，其能誘導(dǎo)凋亡基因的表達，在肝細胞癌中表現(xiàn)出抗腫瘤特性[20]。綜上，預(yù)測的核心靶點參與了ALD的發(fā)病機制，推測溪黃草黃酮類成分可通過作用這些核心靶點發(fā)揮潛在的治療機制。

從KEGG富集通路中可知溪黃草黃酮類成分治療ALD可能通過PI3K/Akt信號通路、FoxO信號通路、p53信號通路等關(guān)鍵通路發(fā)揮作用。其中，PI3K/Akt信號通路通過激活下游相應(yīng)的效應(yīng)分子參與細胞增殖、凋亡、葡萄糖代謝等生理活動發(fā)揮作用。另有研究證實，通過抑制PI3K/Akt信號傳導(dǎo)，降低氧化應(yīng)激和炎癥因子水平，對活化的肝星狀細胞有抑制作用，進而阻止肝纖維化的發(fā)展[21]。在ALD發(fā)病機制中，氧化應(yīng)激與細胞凋亡被認為是其重要的機制之一，而細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，可激活PI3K/Akt信號通路及相關(guān)響應(yīng)因子。推測PI3K/Akt通路為ALD發(fā)病機制的關(guān)鍵信號通路。FOXO蛋白是生長因子和應(yīng)激調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，作為氧化應(yīng)激介體參與氧化應(yīng)激過程，在細胞DNA損傷和修復(fù)、調(diào)控代謝等過程具有重要的作用。p53為腫瘤抑制因子，其調(diào)控細胞增殖、衰老、細胞凋亡等代謝活動，介導(dǎo)癌癥、糖尿病、肝病等疾病的代謝過程。類黃酮物質(zhì)黃腐酚通過調(diào)控NF-κB/p53信號通路抑制人肝癌HepG2的生長、凋亡[22]。上述三條通路在治療ALD中主要參與了氧化應(yīng)激過程、炎癥反應(yīng)、細胞自噬、抗細胞纖維化等過程，可進一步推測溪黃草黃酮類成分調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵通路發(fā)揮治療ALD作用機理。另外，結(jié)合分子對接的技術(shù)，初步模擬成分與靶點之間相互作用關(guān)系，結(jié)合能的大小直接反映預(yù)測結(jié)果的可靠性。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接相結(jié)合的方法，確定溪黃草中黃酮類成分具體藥效物質(zhì)，從多個方面探討了黃酮類成分治療ALD的分子靶點、調(diào)控通路的作用機制，體現(xiàn)了溪黃草黃酮類成分具有多靶點多途徑的作用特點，且其預(yù)測的結(jié)果與文獻報道相符，為后續(xù)深入研究溪黃草黃酮防治ALD的作用機制提供理論依據(jù)。